RNA干擾下調(diào)Gremlin表達(dá)對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞分泌FN、Col Ⅳ的影響.pdf

1、目的:糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,已成為導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的重要原因,也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因。目前并沒有一種有效的方法能夠阻止其發(fā)生、發(fā)展,從根本上防治DN。腎小球系膜病變是DN最突出的病理改變之一,在其病程的早期即存在系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)如纖維連接蛋白(FN)、Ⅳ型膠原(ColⅣ)合成增多,但這種狀態(tài)的具體形成機(jī)制目前尚不明確。有研究表明一系列與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)

2、的因子在DN發(fā)病中起重要作用,其在糖尿病腎病的發(fā)生中表達(dá)或活性增加,包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β),骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)拮抗因子Gremlin,結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)等。
　　greml in是一在進(jìn)化過程中高度保守的分泌型蛋白,分子量24-26 kDa,是半胱氨酸結(jié)超家族成員之一,可以形成異二聚體并拮抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)的作用,特別是BMP-2,4和7。Gremlin調(diào)節(jié)生長(zhǎng)

3、,軟骨發(fā)生和發(fā)育中肢芽的凋亡,在腎臟的形態(tài)形成中也起著重要的作用。有研究表明,gremlin可能在糖尿病腎病系膜細(xì)胞增生、腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的病理過程中發(fā)揮重要作用。我們前期應(yīng)用基因芯片也發(fā)現(xiàn)了gremlin為DN相關(guān)的基因,本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上,采用高糖條件培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞,構(gòu)建并合成以慢病毒為載體、針對(duì)gremlin的shRNA,探討應(yīng)用RNA干擾下調(diào)gremlin表達(dá)對(duì)高糖刺激RMCs細(xì)胞外基質(zhì)分泌、腎臟纖維化的影響及

4、分子機(jī)制。
　　方法:構(gòu)建gremlin基因特異性的短發(fā)夾雙鏈RNA(shRNA)慢病毒GREMLIN-RNAi-LV,感染RMCs后,實(shí)驗(yàn)分為5.5mmol/L葡萄糖、30mmol/L葡萄糖、30mmol/L葡萄糖+GREMLIN-RNAi-LV及30mmol/L葡萄糖+NC-GFP-LV(感染攜帶綠色熒光蛋白的陰性對(duì)照慢病毒)4組,分別處理48h,RT-PCR檢測(cè)gremlinmRNA表達(dá),Western Blot檢測(cè)grem

5、l in蛋白表達(dá),ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清FN、ColⅣ蛋白表達(dá)變化。結(jié)果應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),組間比較采用多重比較的方差分析,p＜O.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:與5.5mmol/L葡萄糖組相比,30mmol/L葡萄糖組gremlin mRNA和蛋白水平顯著升高(P均＜O.05),細(xì)胞外基質(zhì)分泌FN、Col IV蛋白增加(P均＜0.05),而R

6、NA干擾能下調(diào)高糖誘導(dǎo)的gremlin mRNA與蛋白高表達(dá)(P＜0.05),降低細(xì)胞外基質(zhì)FN、Col IV蛋白分泌(P＜O.05)。
　　結(jié)論:慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的gremlin高表達(dá),降低細(xì)胞外基質(zhì)分泌,改善腎臟纖維化,抑制gremlin表達(dá)后無(wú)論是腎臟早期增生、肥大、細(xì)胞增殖還是晚期腎臟細(xì)胞凋亡、腎臟纖維化及腎功能惡化都得到改善,抑制gremlin表達(dá)后出現(xiàn)這些作用可能是通過使BMP7的表達(dá)及活性恢復(fù)