小鼠著床前胚胎特異ERV相關(guān)長(zhǎng)非編碼RNA的定向篩選及功能研究.pdf

1、著床前胚胎發(fā)育是一個(gè)受到精密調(diào)控的發(fā)育過程。研究著床前胚胎發(fā)育機(jī)制對(duì)于生殖生物學(xué)及再生醫(yī)學(xué)都有深遠(yuǎn)意義，因此著床前胚胎發(fā)育一直倍受矚目。在著床前胚胎發(fā)育過程中會(huì)發(fā)生一系列特異事件，如合子基因激活(zygote genome activation，ZGA)。長(zhǎng)非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)參與調(diào)控已經(jīng)成為新的生物學(xué)研究領(lǐng)域。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，大量lncRNA在早期胚胎中被發(fā)現(xiàn)，但是，目前還沒有研

2、究能夠回答有沒有一些lncRNA會(huì)參與到著床前胚胎發(fā)育調(diào)控過程中，如果有，這些lncRNA以怎樣的機(jī)制參與調(diào)控。內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒(Endogenous retroviruses，ERVs)是進(jìn)化上內(nèi)化于高等有顎脊椎動(dòng)物基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列元件。內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒序列廣泛分布，占人類基因組的8％，占小鼠基因組的10％。內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒序列曾一度被認(rèn)為是垃圾DNA，但越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒序列參與了多方面生物學(xué)調(diào)控。病毒序列編碼的蛋白

3、質(zhì)可參與宿主細(xì)胞功能。有些內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒尚保持轉(zhuǎn)座能力，對(duì)于生殖細(xì)胞內(nèi)基因重組等進(jìn)化相關(guān)事件起到關(guān)鍵作用。我們?cè)缇椭佬∈驟RV在著床前胚胎中轉(zhuǎn)錄，但具體發(fā)揮什么功能尚不清楚。是否存在ERV相關(guān)的lncRNA參與著床前胚胎發(fā)育調(diào)控值得研究。
　　我們針對(duì)ERVs的精心設(shè)計(jì)了半隨機(jī)引物，通過半隨機(jī)擴(kuò)增，從小鼠早期胚胎各時(shí)期篩選mERV相關(guān)未知轉(zhuǎn)錄本，經(jīng)過分子克隆技術(shù)（鏈特異性PCR及RACE等）獲得至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)，分析其是否為l

4、ncRNA。對(duì)明確是lncRNA的未知轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析、表達(dá)模式分析以及功能研究。具體結(jié)果如下;通過PCR及測(cè)序結(jié)果的UCSC比對(duì)分析，我們鑒定出了36個(gè)新轉(zhuǎn)錄本。大部分新轉(zhuǎn)錄本(28/36)是ERV相關(guān)的，與預(yù)期相符。其中23個(gè)是GLN相關(guān)的，5個(gè)是MuERVL相關(guān)的;通過鏈特異性逆轉(zhuǎn)錄PCR以及RACE技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)lnc-GET是GLN，MERVL及MERVK相關(guān)的、可剪切的、有多聚腺苷酸尾的、含兩種剪切突變體的RNA;

5、Dyei是由GLN的LTR轉(zhuǎn)錄的、長(zhǎng)665 nt的、GLN相關(guān)的、含3個(gè)外顯子的RNA。亞細(xì)胞定位分析表明lnc-GET和Dyei定位于核，且主要是染色質(zhì)定位的，因此lnc-GET和Dyei是非編碼的。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及miRNA反義Northern印記實(shí)驗(yàn)排除了lnc-GET和Dyei是miRNA前體的可能性。TaqMan定量PCR實(shí)驗(yàn)及RNA-FISH實(shí)驗(yàn)表明，lnc-GET是2-至4-細(xì)胞胚胎特異表達(dá)的，Dyei是4-細(xì)胞胚胎特異表達(dá)

6、的;干擾lnc-GET導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯于2-細(xì)胞時(shí)期，而干擾Dyei不影響著床前胚胎發(fā)育。干擾lnc-GET的胚胎在培養(yǎng)液中能維持2-細(xì)胞狀態(tài)至少4天而不凋亡。干擾lnc-GET阻滯的胚胎呈BrdU強(qiáng)陽(yáng)性、CAF1陰性，表明阻滯于G2時(shí)期，呈H3第10位精氨酸磷酸化(H3S10ph)染色陽(yáng)性，表明阻滯于G2晚期。γH2A.X免疫熒光染色呈陰性，表明阻滯不是由于DNA損傷導(dǎo)致的。阻滯胚胎內(nèi)，G2/M轉(zhuǎn)換相關(guān)關(guān)鍵細(xì)胞周期蛋白依賴的蛋白酶CD

7、K1以及母源蛋白OCT4和CDX2沒有顯著變化;主要合子基因激活(major ZGA)起始不受影響。我們還發(fā)現(xiàn)臂間衛(wèi)星序列的正義鏈及反義鏈轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平?jīng)]有變化，DNA-FISH結(jié)果顯示臂間環(huán)已經(jīng)變成了染色中心;通過低起始量RNA-seq我們比較了注射對(duì)照鎖核酸(LNA)的對(duì)照晚期2-細(xì)胞胚胎(2225枚)與干擾lnc-GET的阻滯2-細(xì)胞胚胎（2042枚）在majorZGA時(shí)期的基因表達(dá)情況?？傮w上講，在干擾lnc-GET的阻滯2-細(xì)

8、胞胚胎中有723個(gè)基因上調(diào)，521個(gè)基因下調(diào)(FDR≤0.0001，RPKM≥1，2倍以上)，多達(dá)11060個(gè)基因發(fā)生了異常剪切，表明干擾lnc-GET造成了majorZGA嚴(yán)重異常。KEGG通路分析表明干擾lnc-GET主要影響了MAPK信號(hào)通路，表現(xiàn)在ERK1/2-MAPK及LNK/p38-MAPK通路的核心因子表達(dá)量顯著下降。異常剪切基因的GO-BP分析結(jié)果表明發(fā)生異常剪切的基因主要聚類于細(xì)胞周期相關(guān)基因（主要是M周期相關(guān)的）。表

9、明干擾lnc-GET造成的阻滯可能是影響了細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及可變剪切導(dǎo)致的;我們通過pulldown-質(zhì)譜來檢測(cè)lnc-GET結(jié)合的蛋白，鑒定出了hnRNP U、FUBP1、DAZAP1及ILF2。這4個(gè)蛋白定位于晚期2-細(xì)胞及早期4-細(xì)胞核內(nèi)，說明是與lnc-GET共定位的。這4個(gè)蛋白都是剪切復(fù)合體組分，3個(gè)是轉(zhuǎn)錄因子，表明pulldown-質(zhì)譜結(jié)果與RNA-seq結(jié)果相符:lnc-GET可能參與了轉(zhuǎn)錄及剪切調(diào)控;無論通過Wil