長非編碼RNA Gtl2在小鼠胚胎發(fā)育早期的表達調(diào)控及功能研究.pdf

1、長非編碼RNA（lncRNA）是一類不編碼蛋白的RNA分子，廣泛參與多種重要的生物學過程。最近的研究表明，Dlk1-Dio3印記基因簇內(nèi)非編碼RNA（ncRNAs）的活化程度與誘導多能干細胞（iPSCs）的發(fā)育潛能呈正相關。實驗室前期研究顯示此區(qū)間lncRNA Gtl2的表達起始于8細胞時期，同時該區(qū)間內(nèi)重要差異甲基化區(qū)IG-DMR和Gtl2-DMR的甲基化模式在早期胚胎各階段并未發(fā)生變化，推測DNA甲基化不是Gtl2表達調(diào)控的主要因素

2、。本研究以小鼠Dlk1-Dio3印記區(qū)間內(nèi)最重要的lncRNA Gtl2為研究對象，進一步揭示其在早期胚胎中的表達模式和調(diào)控機制，進而對其在早期胚胎中的功能展開研究。
　　本課題首先明確Gtl2在早期胚胎中的動態(tài)表達變化及亞細胞定位。通過RNA FISH對其在桑椹胚、早期囊胚和囊胚中的定位研究顯示，Gtl2在桑椹胚期均勻分布，隨著向囊胚的發(fā)育，其表達逐漸向內(nèi)細胞團（ICM）細胞聚集；而到囊胚時期，其表達幾乎完全集中于ICM細胞，滋

3、養(yǎng)層細胞（TE）細胞中幾乎檢測不到表達信號。在這一發(fā)育過程中Gtl2始終主要在細胞質(zhì)中表達。印記分析顯示，Gtl2在初始表達的桑椹胚時期即為父本印記母本表達。
　　由于Dlk1-Dio3印記簇印記控制區(qū)的DNA甲基化模式無法解釋Gtl2的表達調(diào)控，本研究檢測了Gtl2表達前后重要位點組蛋白修飾的情況。利用微量樣品染色質(zhì)免疫共沉淀(μChIP)方法，對IG-DMR區(qū)和Gtl2啟動子區(qū)的組蛋白修飾檢測發(fā)現(xiàn)，在Gtl2不表達的8-細胞期

4、，這兩個區(qū)域都存在明顯的抑制性組蛋白修飾H3K9me3，而激活性組蛋白修飾H3K4me3較弱；隨著胚胎逐步發(fā)育到桑椹胚和囊胚期，這兩區(qū)域的激活性組蛋白修飾H3K4me3顯著增強，而抑制性組蛋白修飾H3K9me3顯著減弱。結(jié)果提示Gtl2在早期胚胎中表達的啟動可能受到激活性組蛋白修飾 H3K4me3和抑制性組蛋白修飾H3K9me3的協(xié)同調(diào)控。本研究進一步構(gòu)建了靶向Oct4、Sox2和Nanog慢病毒RNA干擾載體，通過透明帶下注射法在早期

5、胚胎發(fā)育過程中分別干擾了Oct4、Sox2和Nanog的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Oct4、Sox2和Nanog干擾后Gtl2的表達也相應發(fā)生了下調(diào)，表明干細胞多能性因子Oct4、Sox2和Nanog對Gtl2表達的調(diào)控具有調(diào)控作用。
　　鑒于Gtl2在胚胎早期發(fā)育過程中獨特的時空表達模式，本研究對其在早期胚胎中的功能進行了初步探索。通過構(gòu)建Gtl2的慢病毒RNA干擾載體結(jié)合透明帶下注射法在早期胚胎中干擾Gtl2的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gtl2干擾后

6、雖然不影響囊胚的發(fā)育率，但卻顯著影響囊胚后期的發(fā)育能力。定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Gtl2干擾后同簇基因、干細胞多能性因子和分化標志蛋白的表達都出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)，提示Gtl2在早期胚胎發(fā)育過程中參與了廣泛的基因表達調(diào)控。
　　綜上所述，lncRNA Gtl2在早期胚胎發(fā)育過程中具有獨特的動態(tài)表達模式和亞細胞定位，其表達受到組蛋白修飾的調(diào)控和干細胞多能性因子的調(diào)控。同時其在早期胚胎中的表達對于胚胎的發(fā)育具有潛在的重要作用，這些結(jié)