非編碼RNA克隆分析及其功能初步研究.pdf

1、近年來，不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子一非編碼RNA(noncodingRNA，ncRNA)被大量發(fā)現(xiàn)，與已知的mRNA、rRNA及tRNA不同，它們不直接參與蛋白質(zhì)的合成。非編碼RNA在各種生物中廣泛存在，它的種類繁多，主要包括：類mRNARNA、microRNA(miRNA)、snRNA、snoRNA、scRNA、pRNA、SRP-RNA、gRNA等。非編碼RNA可影響轉(zhuǎn)錄及染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，參與RNA的加工修飾，調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性及翻譯，

2、還可以影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運。ncRNA以多種機(jī)制發(fā)揮這些作用，如：RNA-RNA(DNA)堿基配對、RNA-蛋白質(zhì)相互作用、模擬其他核酸分子或直接起催化作用。microRNA及類mRNARNA是兩類非常重要的非編碼RNA分子，已有的研究結(jié)果表明它們與細(xì)胞的生長和分化、胚胎的發(fā)育、腫瘤的形成和抑制都有著密切的關(guān)系。本論文對這兩種非編碼RNA分別在發(fā)育、腫瘤及衰老過程中的作用進(jìn)行了初步研究。 microRNA是一類20-25個堿

3、基可調(diào)控其他基因表達(dá)的小分子非編碼RNA，它廣泛存在于各種真核生物中。雖然現(xiàn)在已從多種生物中鑒定出了數(shù)百種miRNA，但仍有大量的miRNA尚未發(fā)現(xiàn)，即使在人體中，實際存在的miRNA數(shù)量也可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過原先預(yù)測的約250條。這就意味有許多miRNA，特別是那些在特定組織或在特定發(fā)育階段表達(dá)的miRNA有待鑒定。對目前已知的miRNA，只有極少數(shù)的功能得到了較完整的研究，大部分miRNA在細(xì)胞中所起的作用對我們來說還是一個有待揭示的謎。由

4、于miRNA分子非常小，表達(dá)量相對較低，容易降解，因此用傳統(tǒng)的方法克隆miRNA比較困難。肝臟是人體的一個及其重要的器官，它承擔(dān)著造血、免疫、消化、解毒、物質(zhì)代謝等多種重要功能。為探討相關(guān)miRNA在肝細(xì)胞中調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制，揭示相關(guān)miRNA在肝細(xì)胞增殖、癌變中的生物學(xué)功能，我們以人胎肝為實驗材料進(jìn)行了miRNA的克隆分析并初步探討了miRNA對細(xì)胞增殖的影響。這部分獲得的主要進(jìn)展有：1.建立了一種新的miRNA基因克隆分析方法，與

5、傳統(tǒng)克隆方法相比，這種方法減少了RNA操作步驟，具有操作簡便、減少RNA降解、無須使用同位素及成功率高等優(yōu)點。 2.建立了一種簡便快速的miRNA表達(dá)檢測方法，這為檢測miRNA在各種組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平，進(jìn)行功能研究提供了良好的工具。 3.利用這種新的miRNA克隆方法，成功地從人胎肝組織中克隆到27條miRNA，經(jīng)過Blast比對、二級結(jié)構(gòu)分析及Northemblot鑒定，發(fā)現(xiàn)其中5條為全新的miRNA基因，均

6、具有miRNA的典型發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體。它們分別被命名為miR-483、miR-484、miR-485、miR-486及miR-487。 4.采用Northernblot方法對部分新克隆到的miRNA分子在肝臟和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行了分析鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-410、miR-485及miR-487在人胎肝中有較高水平的表達(dá)，而在HepG2及HEL-7402肝腫瘤細(xì)胞中表達(dá)很低，表明其與肝腫瘤有關(guān)。 5.我們用反義技術(shù)抑制克

7、隆的15種人miRNA在HepG2細(xì)胞中的作用，用MTT方法檢測對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明miR-483及miR-486被抑制后，HepG2的增殖也受到明顯抑制，這說明miR-483及miR-486這兩種新的miRNA對細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用。 6.采用基于RT-PCR的miRNA分子尋靶技術(shù)及生物信息學(xué)手段對miR-483分子的靶基因進(jìn)行了分析，并篩選到三種候選靶基因。 類mRNARNA是結(jié)構(gòu)與mRNA相似，經(jīng)

8、過剪接去掉內(nèi)含子，3′端有poly(A)尾，但沒有長的開放性閱讀框，不表達(dá)蛋白質(zhì)的一類非編碼RNA。為研究這種非編碼RNA在衰老過程中的作用，我還用AP-PCR技術(shù)分析了乳鼠、青年鼠、老年鼠肝臟的基因表達(dá)差異，共得到6條差異表達(dá)的基因，其中三個基因(Ma、Mc、Mj)在老年鼠中高表達(dá)，Ma在乳鼠及青年鼠肝臟中低表達(dá)，Mc和Mj基因則在乳鼠及青年鼠中都不表達(dá)。這三個基因只與小鼠基因組序列同源，此外無同源序列，可能為未知基因。用RACE技術(shù)

9、分別擴(kuò)增小鼠衰老相關(guān)Mc基因的5′及3′末端，獲得其全長。Mc有兩種不同的剪接形式，其中Mc-1長度為1454bp，Mc-2長度為1219bp。序列分析表明它們都沒有長的開放閱讀框，也沒有翻譯蛋白所必須的Kozak起始保守序列，因此Mc-1及Mc-2是類似mRNA的非編碼RNA基因。這些研究結(jié)果為深入研究ncRNA在衰老過程中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。 本研究建立了一整套miRNA分子克隆、鑒定、功能分析和miRNA作用靶基因篩