利用RNAi干擾技術(shù)研究大鼠附睪特異性基因Ces7的功能.pdf

1、近年來(lái)上海市分子男科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室克隆到一個(gè)附睪特異性表達(dá)基因Ces7（Rat615;R615），經(jīng)序列分析表明，RAT615在氨基酸組成上與羧基酯酶(CEs)有大約50-60％的同源性，Rat615氨基酸序列中包含羧基酯酶家族（絲氨酸水解酶）中所有的保守序列，與已發(fā)現(xiàn)的CES7家族成員具有超過(guò)70％的同源性.在前期的工作已發(fā)現(xiàn)Rat615 mRNA和蛋白在附睪中特異性轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，主要在附睪體部和尾部表達(dá)并分泌至附睪管腔中。實(shí)驗(yàn)已表明，R

2、at615蛋白具有膽固醇酯酶的活性。本文利用RNAi技術(shù)上進(jìn)一步研究了Rat615基因的功能。方法：首先在細(xì)胞水平上篩選能夠敲低Rat615表達(dá)（nt807-825和nt1878-1896）的有效siRNAs片段，然后以慢病毒為載體，在體外構(gòu)建能夠表達(dá)有效siRNAs載體，將其包裝為重組病毒，用包裝好的病毒去感染HEK293T細(xì)胞，感染后2d，用流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡檢測(cè)病毒的滴度.然后將重組好的病毒注入大鼠附睪的尾部，在感染后10d后

3、檢測(cè)Rat615蛋白表達(dá)、精子獲能的情況。
　　 結(jié)果：1、在細(xì)胞水平上成功篩選到兩條能夠敲低Rat615表達(dá)的siRNA1、siRNA2，并構(gòu)建了能夠表達(dá)siRNA1和siRNA2病毒載體，成功制備了Lenti/siRNAl-Rat615、Lenti/siRNA2-Rat615以及對(duì)照Lenti/siRNA-GFP病毒.
　　 2、病毒感染大鼠附睪尾部10d后，附睪尾部中Rat615蛋白以及管腔中Rat615蛋白的含量