COPD與上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)性研究.pdf

1、目的：慢性阻塞性肺疾病(COPD)是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)慢性病，具有高患病率及高死亡率等特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與多個(gè)基因變異相關(guān)，動(dòng)物模型的建立與研究對(duì)了解其發(fā)病機(jī)制尤為重要。本研究旨在探索并構(gòu)建新的小鼠COPD模型，并從小鼠一般狀況、肺組織病理變化等多個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。對(duì)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標(biāo)志物（E-cadherin、α-SMA及collagenⅠ）在COPD模型組及對(duì)照組中表達(dá)情況進(jìn)行觀察，并進(jìn)行半定量PCR，初步篩選出

2、與COPD相關(guān)的候選基因。在小鼠COPD模型、香煙煙霧提取物(CSE)刺激的人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE）及相應(yīng)對(duì)照組中通過(guò)定量PCR、Dot bolt、Western blot及免疫熒光等檢查，研究該候選基因在其中的表達(dá)情況;對(duì)myh14在COPD的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用進(jìn)行探討，為將來(lái)進(jìn)一步研究其在COPD中的具體作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　方法：⑴通過(guò)采用CSE聯(lián)合脂多糖(LPS)滴鼻建立小鼠COPD模型，將20只雄性C57/

3、BL6小鼠隨機(jī)平均分為正常對(duì)照組及COPD模型組，于建模第42天同時(shí)處死小鼠，每組隨機(jī)選取6只小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。⑵觀察對(duì)照組及模型組的一般情況、肺組織病理變化（HE染色、PAS染色）、肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)及肺泡破壞指數(shù)(DI)，免疫組化觀察EMT表現(xiàn)。⑶對(duì)支氣管肺泡灌洗液(BALF)進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)觀察。⑷用兩組小鼠肺組織作為標(biāo)本進(jìn)行半定量PCR初步篩選出與COPD相關(guān)的候選基因。⑸用定量PCR、Dot blot檢測(cè)篩選出的候選基因

4、(myh14)在小鼠肺組織中mRNA及蛋白表達(dá)水平。⑹MTT法選擇細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中最適CSE刺激濃度，按CSE對(duì)細(xì)胞刺激的不同時(shí)間進(jìn)行分組，用定量PCR及Dot blot檢測(cè)myh14在各組細(xì)胞中mRNA及蛋白表達(dá)水平，并通過(guò)免疫熒光法觀察各組細(xì)胞中myh14的分布與表達(dá)。⑺Western blot檢測(cè)CollagenⅠ及α-SMA在COPD模型組及對(duì)照組肺組織中的蛋白表達(dá)水平。8、COPD模型組進(jìn)行myh14與E-cadherin、α-SM

5、A、CollagenⅠ之間相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：①一般情況:觀察兩組小鼠毛發(fā)，活動(dòng)等情況，COPD模型組小鼠較對(duì)照組出現(xiàn)活動(dòng)減少，消瘦，呼吸困難等表現(xiàn)，對(duì)照組小鼠存活率100％;模型組存活率為80％。②肺組織病理學(xué)及形態(tài)結(jié)構(gòu)變化:對(duì)照組氣道及肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰，較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔無(wú)明顯增厚及斷裂出現(xiàn)。模型組氣道上皮結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)黏液高分泌，肺泡壁斷裂并融合成肺大泡，有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組MLI及DI均較對(duì)照組升高(P

6、＜0.05)。③BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù):COPD模型組BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例均較對(duì)照組升高(P＜0.05)。④免疫組化及相關(guān)性分析:對(duì)照組氣道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量myh14陽(yáng)性表達(dá)，而模型組myh14表達(dá)減少(P＜0.05);模型組E-cadherin較對(duì)照組減少(P＜0.05);模型組氣道平滑肌增生較對(duì)照組明顯;模型組氣道壁膠原沉積明顯，CollagenⅠ表達(dá)較對(duì)照組增多(P＜0.05)。模型組氣道上皮myh14

7、、E-cadherin平均光密度值(IOD/area)較對(duì)照組減少(P＜0.05)，模型組CollagenⅠ平均光密度值(IOD/area)較對(duì)照組升高(P＜0.05)。平均光密度值相關(guān)性分析顯示模型組myh14與E-cadherin呈正相關(guān)(r=0.967，P＜0.01)，與CollagenⅠ呈負(fù)相關(guān)(r=-0.925，P＜0.01)。⑤半定量PCR篩選COPD相關(guān)候選基因結(jié)果:經(jīng)過(guò)對(duì)兩組小鼠肺組織進(jìn)行半定量PCR COPD相關(guān)候選基

8、因篩選，發(fā)現(xiàn)Slc9a2、Foxj1及Gif在兩組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，Chrm1、Sprr2b、Rag1、Dusp5、Cldn2、Cldn22、Scin差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Morc3、Rela、Akt1、Pik3r1、IL6ra、Myh14、Tpm3、Crabp2、Sprr2a2、Lyn、Srrm4、C/EBP、Gabarap、Elk1、Hk2、Tjap1、Strada兩組間有明顯差異(P＜0.01)，選取

9、差異明顯的myh14作為COPD相關(guān)基因進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。⑥CSE細(xì)胞毒性試驗(yàn):對(duì)不同CSE濃度刺激24h的16HBE細(xì)胞進(jìn)行MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活性，在CSE濃度≤2.5％時(shí)，細(xì)胞活性降低不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，當(dāng)CSE濃度大于2.5％時(shí)，細(xì)胞活性出現(xiàn)明顯下降(P＜0.01)。故選用2.5％CSE進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。⑦實(shí)時(shí)熒光定量PCR: myh14在小鼠COPD模型組中相對(duì)mRNA含量（RQ值）較對(duì)照組下降(P＜0.05

10、)，CSE對(duì)16HBE細(xì)胞不同時(shí)間刺激(8h、24h)組中myh14mRNA水平均較對(duì)照組下降(P＜0.01)，CSE8h及24h刺激組間存在差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。8、Dot blot、Westem blot結(jié)果及相關(guān)性分析:Dot blot結(jié)果顯示，COPD模型組myh14蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組下降(P＜0.05)，Western blot結(jié)果顯示模型組中α-SMA及collagenⅠ蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組升高(P＜

11、0.05);相關(guān)性分析顯示模型組中蛋白表達(dá)水平上myh14與α-SMA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.833，P＜0.05)，與collagen呈負(fù)相關(guān)(r=-0.953，P＜0.01)。16HBE細(xì)胞經(jīng)CSE刺激(8h、24h)后，Dot blot顯示myh14在蛋白表達(dá)水平上均較對(duì)照組明顯下降(P＜0.01)，CSE8h及24h刺激組間存在差異性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。9、16HBE細(xì)胞中myh14免疫熒光檢測(cè):綠色熒光為myh1

12、4在細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)，myh14表達(dá)于細(xì)胞胞漿內(nèi)，CSE刺激組(8h，24h)較對(duì)照組熒光表達(dá)明顯減弱(P＜0.01)，不同CSE刺激組間存在差異，且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：⑴CSE聯(lián)合LPS滴鼻可成功構(gòu)建小鼠COPD模型。⑵COPD中存在EMT現(xiàn)象的發(fā)生。⑶myh14可在人支氣管上皮細(xì)胞及小鼠支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)，且在小鼠COPD模型及經(jīng)CSE刺激的16HBE細(xì)胞中存在mRNA及蛋白水平下降。⑷myh14可