轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1與腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞間質(zhì)化相關(guān)性研究.pdf

1、轉(zhuǎn)移是腫瘤的惡性標(biāo)志之一，也是導(dǎo)致臨床治療失敗和患者死亡的最主要原因。nm23-H1基因是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)制十分復(fù)雜，許多機(jī)制目前尚未闡清。上皮細(xì)胞間質(zhì)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮性腫瘤細(xì)胞獲得侵潤(rùn)和遷徙能力的重要方式。目前還沒(méi)有關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1與EMT之間相關(guān)性的報(bào)道。一些間接的證據(jù)顯示nm23-H1與EMT之間存在著一

2、定的聯(lián)系。為了進(jìn)一步闡述nm23-H1抑制腫瘤的分子機(jī)制，為尋找腫瘤轉(zhuǎn)移治療新的靶點(diǎn)，我們對(duì)于nm23-H1基因與腫瘤細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)化的相關(guān)性進(jìn)行了研究，并對(duì)nm23-H1發(fā)揮作用的可能的信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行了探討。
　　 第一部分腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1對(duì)于肺腺癌細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)化的影響
　　 目的:研究轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1對(duì)于肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549以及A549-99上皮細(xì)胞間質(zhì)化的影響。
　　 方法:

3、我們應(yīng)用EMT誘導(dǎo)劑刺激細(xì)胞，使其發(fā)生EMT。應(yīng)用nm23-H1 siRNA和含有nm23-H1 cDNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)nm23-H1基因的表達(dá)水平，研究nm23-H1基因?qū)τ谀[瘤細(xì)胞EMT的影響。通過(guò)觀察形態(tài)學(xué)的變化確認(rèn)nm23-H1基因?qū)τ贓MT表型的影響;用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷徙能力的變化;通過(guò)小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的變化。應(yīng)用western blot和免疫熒光的方法來(lái)檢測(cè)EMT標(biāo)志物蛋白水平表達(dá)的變化，應(yīng)用Real-time PC

4、R檢測(cè)了EMT標(biāo)志物mRNA水平的變化。我們還通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物以及細(xì)胞周期的改變。
　　 結(jié)果:細(xì)胞經(jīng)過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)由多角形的典型上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化成為紡錘形的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞的遷移能力、侵襲能力增強(qiáng)。上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白和mRNA水平表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物β-catenin和fibronectin蛋白和mRNA水平表達(dá)增加。其他的EMT誘導(dǎo)劑如HGF、IL-6、血清等對(duì)于

5、EMT標(biāo)志物影響的結(jié)果相似，但不如TGF-β1明顯。細(xì)胞nm23-H1基因沉默后，細(xì)胞經(jīng)過(guò)相同條件的TGF-β1誘導(dǎo)EMT，細(xì)胞更易與獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征。表現(xiàn)為紡錘形的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)更加明顯，細(xì)胞的遷移能力、侵襲能力增強(qiáng)。上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白和mRNA水平表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物β-catenin和fibronectin蛋白和mRNA水平表達(dá)增加，并同時(shí)獲得某些肺癌干細(xì)胞的特征。對(duì)于細(xì)胞周期的影響不是十分明顯。而當(dāng)nm2

6、3-H1基因過(guò)表達(dá)或恢復(fù)表達(dá)后，則可以一定程度上逆轉(zhuǎn)細(xì)胞EMT標(biāo)志物的表達(dá)。
　　 結(jié)論:腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1可以通過(guò)抑制腫瘤EMT的發(fā)生來(lái)發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。
　　 第二部分腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子snail抑制肺腺癌細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化
　　 目的:轉(zhuǎn)錄因子snail在調(diào)節(jié)EMT當(dāng)中起到關(guān)鍵作用。研究轉(zhuǎn)錄因子snail是否對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1抑制肺腺癌細(xì)胞上皮

7、細(xì)胞間質(zhì)化的過(guò)程。
　　 方法:應(yīng)用western blot分別檢測(cè)了nm23-H1沉默與過(guò)表達(dá)之后snail蛋白水平表達(dá)的變化，用Real-time PCR檢測(cè)了nm23-H1基因沉默后mRNA水平的變化，應(yīng)用雙報(bào)告基因的方法研究了snail啟動(dòng)子的活性變化。其次應(yīng)用snail siRNA和含有snail cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，確定snail是否影響nm23-H1基因?qū)τ贓MT的抑制作用。通過(guò)westem blot檢測(cè)了EMT

8、標(biāo)志物蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1沉默后，TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞EMT，轉(zhuǎn)錄因子snail在蛋白和mRNA水平表達(dá)增加，啟動(dòng)子活性增高。當(dāng)nm23-H1過(guò)表達(dá)后，轉(zhuǎn)錄因子snail蛋白的表達(dá)水平減低。轉(zhuǎn)錄因子snail基因沉默后，只能部分逆轉(zhuǎn)nm23-H1沉默后細(xì)胞EMT后蛋白標(biāo)志物的變化;而當(dāng)轉(zhuǎn)染snail cDNA后，nm23-H1沉默對(duì)于某些間質(zhì)標(biāo)志物仍然有促進(jìn)作用。顯示出nm23-H1可以部分通過(guò)

9、轉(zhuǎn)錄因子snail來(lái)發(fā)揮其抑制EMT的作用，但還可能通過(guò)其他的機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生。
　　 結(jié)論:腫瘤抑制基因nm23-H1可以部分通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子snail抑制腫瘤EMT的發(fā)生，進(jìn)而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，但是nm23-H1基因還可能通過(guò)其他因子來(lái)起作用。
　　 第三部分腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1抑制肺腺癌細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)化信號(hào)通路的研究
　　 目的:研究細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)通路在介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1抑

10、制肺腺癌細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)化中的作用，進(jìn)一步揭示nm23-H1抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　 方法:應(yīng)用了影響EMT較為重要的信號(hào)通路的抑制劑，用來(lái)篩選相關(guān)的信號(hào)通路，并用western blot檢測(cè)了EMT標(biāo)志物蛋白以及TGF-β和Src信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白在應(yīng)用抑制劑前后以及nm23-H1基因沉默前后表達(dá)的變化。我們還同時(shí)檢測(cè)了nm23-H1作用蛋白STRAP基因沉默后EMT標(biāo)志物蛋白以及TGF-β信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白表達(dá)的變化。

11、
　　 結(jié)果:nm23-H1基因沉默后，在相同的TGF-β1濃度下，TGF-β信號(hào)通路強(qiáng)度增加，Src蛋白的活性增加更明顯;nm23-H1過(guò)表達(dá)后能夠逆轉(zhuǎn)相關(guān)蛋白的表達(dá)。信號(hào)通路抑制劑的結(jié)果顯示，Src蛋白在nm23-H1基因抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，腫瘤抑制基因nm23-H1可以與STRAP協(xié)同作用抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT。
　　 結(jié)論:腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1可以通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)TGF