RACK1在食管鱗癌預后及進展中的作用及與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分、RACK1在人體食管鱗癌組織中的表達及其與預后的相關(guān)性分析
　　背景：食管癌是我國最為常見的消化道惡性腫瘤之一。世界衛(wèi)生組織最新的惡性腫瘤流行病學報告顯示，我國食管癌的發(fā)病及死亡人數(shù)均超出世界一半以上;每年中國大陸食管癌新發(fā)病例28.7萬例，發(fā)病率為21.88/10萬，居各類惡性腫瘤第5位;死亡20.8萬例，死亡率為15.85/10萬，居第4位。我國食管癌發(fā)病的組織類型與西方國家明顯不同，95％以上為食管鱗癌(esoph

2、ageal squamous cell cancer，ESCC)，而西方國家則腺癌多發(fā)。我國人口基數(shù)大，加之食管癌發(fā)病率高，為更好地研究食管鱗癌提供了優(yōu)勢資源。盡管近年來治療技術(shù)不斷進步，但因食管癌惡性程度高、發(fā)展快、復發(fā)率高等特點，加之手術(shù)切除難度大、藥物治療效果欠佳等因素，食管癌患者的5年生存率仍不超過14％。改善預后是目前食管癌治療亟待解決的問題，而尋找特異性與敏感性較高的預后指標，并以其為指導開展和實施個體化治療，使每位患者最大

3、程度的治療獲益，這也是目前食管癌治療的最終目標。
　　激活的蛋白激酶C受體1(receptor for activated C kinase1，RACK1)分子是一種錨定蛋白，含有7個WD-40結(jié)構(gòu)域，RACK1分子通過該結(jié)構(gòu)域和其他的分子結(jié)合，共同形成復合物，進而發(fā)揮各種病理及生理功能。人RACK1基因是高度保守的，含有8個外顯子和7個內(nèi)含子，位于人的5號染色體上(5q35.3)，因RACK1的七個β螺旋組成的空間結(jié)構(gòu)可以提供多

4、種蛋白結(jié)合位點，故可為多種蛋白之間的相互作用提供作用表面。RACK1既可以作為PKC的錨定蛋白，還可以招募其它蛋白，發(fā)揮支架蛋白的作用。
　　RACK1可以與多種信號分子結(jié)合，在信號轉(zhuǎn)導通路中發(fā)揮重要的作用，并可參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與腫瘤的關(guān)系十分密切，研究發(fā)現(xiàn)RACK1在人惡性腫瘤中可表達上調(diào)，例如非小細胞肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、口腔鱗癌等，并且其表達水平與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況相關(guān)。不僅如此，RACK1還被證實可以預測多種惡

5、性腫瘤的預后，如乳腺癌、肝癌、口腔鱗癌等。但是作為中國發(fā)病率較高的食管鱗癌，RACK1與此種惡性腫瘤的預后關(guān)系目前研究甚少。
　　目的：
　　1.研究RACK1蛋白在人食管鱗癌組織中的表達情況;
　　2.探討食管鱗癌患者中RACK1蛋白的表達與患者長期預后的關(guān)系。
　　方法：
　　1.研究對象
　　收集自2007年1月至2007年12月來我院胸外科行食管癌手術(shù)的患者，2007年在我院有238例患者行食

6、管癌手術(shù)，術(shù)前無任何輔助治療的患者納入本次研究。所有入組病例必須有明確病理診斷為食管鱗癌，且有胸部及腹部CT結(jié)果。病例收集時須詳細記錄患者的性別、年齡、腫瘤發(fā)病部位、病變長度、腫瘤最大直徑、TNM分期、分化程度、治療方案等，并加以分析。排除標準:病理類型為非鱗癌;缺乏病理診斷結(jié)果;術(shù)前曾行輔助治療;術(shù)后30天內(nèi)死亡;不配合以致難以獲得完整病例資料。最終有100例患者納入本研究，其中男性患者79例，女性患者21例，年齡中位數(shù)為60歲。

7、r>　　2.數(shù)據(jù)隨訪
　　采用電話隨訪的形式，自我院病案室收集患者病歷資料時記錄患者聯(lián)系方式，對入組患者進行隨訪。隨訪截止時間為2013年1月31日。
　　3.標本采集
　　根據(jù)住院號及病理號自我院病理科查詢?nèi)虢M患者的手術(shù)石蠟標本，選擇手術(shù)切除的腫瘤部位行病理切片，同時選取腫瘤周圍組織行病理切片，用作對照。切片厚度約為5μm。
　　4.免疫組織化學染色及結(jié)果判斷按照方法3中操作獲得病理切片后，我們對其進行免疫組織

8、化學染色，選擇5個具有代表性的高倍視野(10×40倍)，計數(shù)IHC標記定位準確的陽性細胞占腫瘤細胞的比例并記分。細胞數(shù)占腫瘤細胞數(shù)的0％記為0分，1％-24％記為1分，25％-49％記為2分，50％-74％記為3分，75％以上記為4分;染色強度以無著色、弱、中、強分類，依次記為0，1，2，3分;最后計算兩種記分的乘積，所得結(jié)果可為:0、1、2、3、4、6、8、9、12，將0-4列為RACK1陰性表達組，6-12列為RACK1陽性表達組。

9、
　　結(jié)果：
　　1.RACK1蛋白在食管鱗癌組織中的表達情況RACK1蛋白在人體食管鱗癌組織中的主要著色部位在細胞漿，偶見細胞核著色。根據(jù)RACK1表達情況將患者分為陽性表達和陰性表達兩組，100例患者中RACK1蛋白陽性表達者有59例，陰性表達者有41例。
　　陽性表達組患者中男性占47例，女性占12例，陰性表達組患者中男性占32例，女性占9例，男性發(fā)病率較高，符合食管癌發(fā)病特點，但是并未達到統(tǒng)計學意義的水平(P=

10、0.846)。陽性表達組患者平均年齡為61.9歲，陰性表達組患者平均年齡為60.4歲，兩組患者年齡無統(tǒng)計學差異，P=0.416。另外兩組患者的發(fā)病部位、N分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率是否大于0.2、TNM分期、組織學分化程度、治療方案也無明顯統(tǒng)計學差異。對比兩組患者，我們發(fā)現(xiàn)患者的腫瘤長度(P=0.012)、腫瘤直徑小于3cm的比例(P=0.047)、T分期(P=0.032)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.038)差異達到統(tǒng)計學意義水平。
　　2.

11、RACK1蛋白組織表達與食管鱗癌患者預后的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示RACK1陽性表達患者的總體生存率為27.1％，而RACK1陰性表達患者為56.1％，log-rank檢驗分析發(fā)現(xiàn)總體生存率差異有明顯統(tǒng)計學意義，P=0.002。在無進展生存率方面，RACK1陽性表達組也顯著低于陰性表達組，差異達到統(tǒng)計學水平，P=0.001。
　　對影響患者總體生存率和無進展生存率的各因素進行單因素分析后將RACK1表達、T分期

12、、N分期、淋巴結(jié)陽性、陽性淋巴結(jié)比率以及TNM分期(P值均小于0.05)納入進行多因素分析。多因素分析后發(fā)現(xiàn)，RACK1表達（RACK1陰性:HR0.532，95％ CI0.301-0.942，P=0.030）是影響患者總體生存率的獨立預后因素。在患者無進展生存率方面上，RACK1表達(RACK1陰性:HR0.523，95％ CI0.294-0.929，P=0.027)是患者的獨立預后因素。
　　結(jié)論：
　　1.RACK1在

13、食管鱗癌組織中存在差異表達;
　　2.RACK1陽性表達患者總體生存率和無進展生存率均低于陰性表達患者，RACK1高表達患者預后差。
　　第二部分、RACK1與食管鱗癌進展的相關(guān)性研究
　　背景：食管癌預后較差的原因有很多，除了篩查診斷手段的不完善和治療失敗，進展較快也是一個很重要的因素，而高侵襲性和高轉(zhuǎn)移傾向的生物學行為特點則是食管癌病程進展的根本原因。因此，我們迫切需要深入理解食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機制，尋找治療新靶點

14、。鑒于我國食管癌發(fā)病的病理類型中鱗癌發(fā)生率較高，我們以食管鱗癌為對象展開研究。
　　RACK1作為銜接蛋白，可以招募各種信號通路有關(guān)的因子或蛋白，參與信號通路的調(diào)節(jié)，進而調(diào)整細胞周期或者細胞凋亡等，最終實現(xiàn)其對腫瘤進展的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)RACK1通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路的活性進而促進乳腺癌細胞增殖，還通過與RhoA的相互作用繼而活化RhoA/Rho激酶通路，促進乳腺癌細胞遷移，此外RACK1能夠調(diào)節(jié)細胞中Ki-Ras介導的信

15、號通路，并能影響細胞形態(tài)。然而由于RACK1可以與多種蛋白分子結(jié)合，其對腫瘤細胞增殖、遷移能力等的影響并不一致，RACK1可以抑制細胞周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)的磷酸化，延緩細胞周期進程，發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細胞生長的作用。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn)RACK1表達與人體食管鱗癌的腫瘤直徑是否小于3cm、腫瘤長度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，根據(jù)我們的前期研究成果及現(xiàn)有的報道，我們推測RACK1與

16、食管鱗癌進展有關(guān)，RACK1的表達水平可以影響食管癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力。
　　目的：
　　1.構(gòu)建RACK1基因穩(wěn)定敲減的食管癌細胞系;
　　2.檢測RACK1基因敲減后食管癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的改變;
　　3.檢測PKC激活劑或抑制劑預處理后食管癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的改變。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)
　　用添加了10％胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)Eca109及EC970

17、6細胞株，置于37℃、5％CO2、95％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.shRNA轉(zhuǎn)染及穩(wěn)篩根據(jù)RACK1的基因序列，委托上海吉瑪生物有限公司設(shè)計合成shRNA及其干擾表達載體pGPU6/GFP/Neo。根據(jù)Invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000的操作說明書進行細胞轉(zhuǎn)染。用G418對轉(zhuǎn)染后的食管鱗癌Eca109和EC9706細胞進行篩選。建立RACK1穩(wěn)定敲減的細胞系。
　　3.細胞接受藥物預

18、處理細胞處于對數(shù)生長時，用完全培養(yǎng)基配置佛波酯PMA/TPA，調(diào)整濃度至100nM，并以此更換細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)20小時后更換為新鮮完全培養(yǎng)基。同樣方法加入星孢菌素staurosporine(SP)。
　　4.細胞總蛋白提取及Western Blot用RIPA裂解液處理細胞并將產(chǎn)物經(jīng)14000rpm4℃離心10min，收集上清液獲得總蛋白。應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液并煮沸使蛋白變性，凝膠電泳分離，將分離所得蛋白條帶通過

19、轉(zhuǎn)移電泳轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5％脫脂奶粉室溫封閉2小時，依次加一抗二抗孵育。次日用ECL化學發(fā)光法對蛋白條帶進行檢測。
　　5.克隆實驗
　　用0.25％胰蛋白酶消化對數(shù)生長期細胞制成細胞懸液，將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，計數(shù)、接種，常規(guī)培養(yǎng)2-3周，出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)。用0.1％的結(jié)晶紫溶液室溫染色1小時、顯微鏡下計數(shù)。
　　6.裸鼠移植瘤模型及移植瘤伊紅-蘇木素(HE)染色取處于對數(shù)生長的

20、細胞，制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×107個/ml。用1ml注射器抽吸0.2ml細胞懸液注入裸鼠后背部，每五天測量腫瘤的長徑a和短徑b，腫瘤體積計算公式為Vmm3=a×b2×0.5。根據(jù)腫瘤體積繪制腫瘤的生長曲線。4周后處死老鼠，小心剝離腫塊，游標卡尺測量腫瘤體積。將移植瘤標本制成病理切片，進行HE染色。
　　7.Transwell遷移、侵襲實驗用無血清培養(yǎng)基制備細胞懸液，取細胞懸液200μl加入Transwell小室，下室加入

21、500μl含胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時后，用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞并計數(shù)。侵襲實驗需要首先包被基底膜，其他步驟同遷移實驗。
　　結(jié)果：
　　1.食管癌細胞中RACK1的表達及RACK1敲減的驗證Western Blot驗證了RACK1在人食管癌細胞系Eca109和EC9706中均表達，RT-PCR發(fā)現(xiàn)shRNA轉(zhuǎn)染后RACK1mRNA表達量降低，Western Blot進一步驗證了轉(zhuǎn)染后兩種細胞中RACK1蛋白水平的降低。

22、
　　2.RACK1基因敲減后食管癌細胞增殖、遷移、侵襲能力變化的檢測體內(nèi)及體外實驗證實RACK1基因敲減后，Eca109和EC9706增殖能力降低?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組克隆形成數(shù)明顯降低(Eca109P=0.0044; EC9706 P=0.0008)。裸鼠移植瘤模型進一步證明了此結(jié)果，RACK1穩(wěn)定敲減后的細胞所形成的移植瘤的瘤重(Eca109 P=0.0003; EC9706P=0.0029)、瘤體積(

23、Eca109 P=0.0119; EC9706 P=0.0192)均顯著低于對照組。
　　Transwell實驗證實RACK1基因敲減后Eca109和EC9706遷移、侵襲能力降低。RACK1敲減后的Eca109細胞和EC9706細胞遷移細胞數(shù)均顯著小于對照組(Eca109 P=0.0108，EC9706 P=0.0037)。RACK1敲減后的Eca109細胞和EC9706細胞侵襲細胞數(shù)均顯著小于對照組(Eca109 P=0.00

24、14，EC9706 P=0.0133)。
　　3.PKC激活劑PMA/TPA、 PKC抑制劑staurosporine(SP)分別預處理食管癌細胞后其增殖、遷移、侵襲能力變化的檢測PMA預處理后的Eca109和EC9706的細胞克隆數(shù)顯著高于未行預處理的細胞，(Eca109 P=0.0012; EC9706 P=0.0015)，SP預處理組則顯著低于對照組(Eca109 P=0.0016; EC9706 P=0.0059)。裸鼠移

25、植瘤實驗中，PMA預處理后的Eca109和EC9706細胞形成的移植瘤瘤重、瘤體積均顯著高于對照組（瘤重:兩組細胞P＜0.0001;瘤體積:Eca109 P=0.0288，EC9706 P=0.0405），SP預處理組則顯著低于對照組(瘤重:Eca109 P=0.0001，EC9706 P=0.0002;瘤體積:Eca109P=0.0308, EC9706 P=0.0103)。
　　PMA預處理組Eca109和EC9706的遷移細

26、胞數(shù)顯著高于對照組(Eca109P=0.0040; EC9706 P=0.0015)，SP預處理組則顯著低于對照組(Eca109 P=0.0012;EC9706 P=0.0006)。PMA預處理組Eca109和EC9706的侵襲細胞數(shù)顯著高于對照組(Eca109 P=0.0448; EC9706 P=0.0138)，SP預處理組則顯著低于對照組(Eca109P=0.0049; EC9706 P=0.0007)。
　　結(jié)論：

27、　　1.RACK1敲減后食管癌細胞Eca109和EC9706的增殖能力降低，所形成的裸鼠移植瘤的重量及體積降低，細胞的遷移、侵襲能力降低。
　　2.PKC激活劑PMA/TPA預處理食管癌細胞Eca109和EC9706后，細胞的增殖能力升高，裸鼠成瘤能力升高，細胞遷移、侵襲能力升高，而SP預處理細胞后則均降低。
　　第三部分、RACK1在食管鱗癌進展中的作用機制與EMT的相關(guān)性的初步探討
　　背景：食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移是一個

28、連續(xù)過程，涉及腫瘤細胞粘附性下降、基質(zhì)降解、腫瘤細胞遷移和新生血管形成等多個環(huán)節(jié)。研究表明，癌細胞主要通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)獲得遷移、侵襲能力，進而突破基底膜發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。EMT是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，癌細胞經(jīng)歷EMT后粘附性下降或消失，細胞運動能力增強，從而獲得突破基底膜、侵襲周圍組織的能力，進入淋巴或血管到達遠處臟器，通過間質(zhì)上

29、皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal epithelial transition，MET)形成新的腫瘤即轉(zhuǎn)移瘤。體內(nèi)、體外實驗證明了癌細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移前有EMT的發(fā)生。這些都提示，EMT是腫瘤早期轉(zhuǎn)移啟動過程中的重要組成部分，阻斷EMT的發(fā)生可能抑制腫瘤早期轉(zhuǎn)移。
　　RACK1的多蛋白結(jié)合表面賦予了其功能多樣化的生物學特性，RACK1可以與多種因子結(jié)合，進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的運動遷移能力、侵襲能力、增殖及抗凋亡能力等，發(fā)揮其調(diào)節(jié)腫瘤進展的

30、作用。在第二部分的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，RACK1可以促進食管鱗癌增殖、侵襲和遷移，進而促進腫瘤進展。而EMT作為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要途徑，是否參與了RACK1促進食管鱗癌進展的過程，目前研究甚少。
　　已有報道證實，人乳腺癌細胞中高表達RACK1可以引起EMT過程中間質(zhì)標志物（Vimentin和α-SMA）表達的上調(diào)及上皮標志物（E-Cadherin和CK-19）表達的下調(diào)。結(jié)合前期結(jié)果和已有的報道，我們推測EMT可能參與了RACK1

31、促進腫瘤進展的過程。
　　目的：
　　探討RACK1促進食管鱗癌進展是否與EMT有關(guān)。
　　方法：
　　1.細胞總蛋白提取及Western Blot方法同前。
　　2.免疫組織化學染色及結(jié)果判斷方法同前。
　　結(jié)果：
　　1.食管癌細胞中E-cadherin和Vimentin的表達與RACK1表達的相關(guān)性與對照組相比較，RACK1敲減后Eca109和EC9706細胞E-cadherin表達水平升

32、高，Vimentin表達水平降低。
　　2.食管鱗癌組織E-cadherin和Vimentin的表達與RACK1表達的相關(guān)性患者食管鱗癌組織中E-cadherin表達與RACK1的表達呈負相關(guān)，Vimentin表達與RACK1的表達呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　食管鱗癌細胞及組織中RACK1表達與EMT標志物E-cadherin和Vimentin表達有關(guān)，與E-cadherin表達呈負相關(guān)，與Vimentin表達呈正相關(guān)