基于冬蟲夏草指標性蛋白質(zhì)IP4的ELISA定量評價新方法研究.pdf

1、冬蟲夏草為麥角菌科冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc.寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上形成的幼蟲尸體及子座的干燥復合體，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥，具有補腎益肺，止血化痰的功效。冬蟲夏草菌寄主昆蟲為蝙蝠蛾科多屬動物的幼蟲，主要分布于四川、西藏、青海、甘肅、云南，海拔2800 m以上的青藏高原高山草甸地區(qū)，分布環(huán)境生態(tài)脆弱，近年來由于全球變暖，雪線上移，分布區(qū)域日趨減少。同時由于冬蟲夏草特殊的藥理作用，其在藥用

2、、保健等用量日益增加，國內(nèi)外市場需求量高，價格連年翻升，供需嚴重不足，且目前無成熟的人工繁殖技術(shù)，造成市場上冬蟲夏草摻假、摻偽現(xiàn)象嚴重。據(jù)報道冬蟲夏草偽品引起頭暈、惡心等副作用，嚴重影響了冬蟲夏草的用藥安全。部分偽品其外觀、粉末特征與正品極其相似，藥典現(xiàn)有指標性成分腺苷非正品所特有，難以形成規(guī)范可操作的新標準。冬蟲夏草的鑒定研究成為研究熱點，亟需新的鑒定方法。
　　作為初級代謝產(chǎn)物的蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定的種屬特異性，且在生物體內(nèi)以及不同

3、部位間都具有穩(wěn)定的含量。課題組前期研究已經(jīng)證實正品冬蟲夏草具有特異的蛋白質(zhì)，可作為鑒定的指標性組分，并利用雙向電泳技術(shù)（2-DE）分離冬蟲夏草蛋白，獲得冬蟲夏草與偽品電泳圖譜，篩選得26個指標性蛋白斑點作為冬蟲夏草指標性蛋白質(zhì)，可定性鑒別冬蟲夏草。本研究主要在前期研究的基礎上開展了以下工作：
　　1．雙向電泳方法驗證冬蟲夏草指標性蛋白質(zhì)組分
　　前期課題組采用雙向電泳技術(shù)（2-DE）對冬蟲夏草及偽品進行分析，篩選出冬蟲夏草及

4、偽品指標性蛋白質(zhì)26個。本實驗在課題組前期實驗基礎上，繼續(xù)優(yōu)化2-DE條件，建立冬蟲夏草蛋白質(zhì)2-DE標準操作流程，并通過PDQUEST軟件比對不同產(chǎn)地蛋白質(zhì)2-DE共有蛋白圖譜與偽品2-DE圖譜，從26個指標性蛋白斑點中驗證得到（核實）21個指標性蛋白質(zhì)。
　　2．冬蟲夏草指標性蛋白質(zhì)的鑒定分析
　　21個指標性蛋白質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜分析后歸納其生物功能。結(jié)果表明21個指標性蛋白質(zhì)中參與DNA損傷修復占4％，參與mRNA翻譯、轉(zhuǎn)錄過

5、程蛋白質(zhì)占9%，參與免疫應答過程蛋白質(zhì)占4%，參與細胞分裂增殖過程的蛋白質(zhì)占4%；參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運等，具有載體功能蛋白質(zhì)占13%，參與蛋白質(zhì)折疊、再折疊過程蛋白質(zhì)比例為8%，輔助恢復未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)恢復活性；與膜內(nèi)蛋白、細胞骨架相關(guān)蛋白質(zhì)占大多數(shù)，比例為38%，參與胞吞作用，細胞骨架重排，膜蛋白質(zhì)運輸和再循環(huán)，與細胞運動性有關(guān)。對指標性蛋白的功能分析為后期實驗篩選具生物活性指標性蛋白質(zhì)奠定基礎。
　　其中IP4（指標性蛋白質(zhì)4

6、）屬氰酸合酶，是催化其氰酸鹽水解的酶，冬蟲夏草菌可通過氰酸合酶水解克服環(huán)境氰酸鹽的毒性或分解氰酸，作為氮的來源。結(jié)合前期2-DE實驗結(jié)果，IP4豐度高，分離度及穩(wěn)定性較好，因此確定其為后續(xù)實驗指標性蛋白。
　　3.冬蟲夏草指標性蛋白質(zhì)IP4的制備與鑒定
　　在獲得IP4基本信息的基礎上，建立并優(yōu)化PAGE、HPLC等尋找冬蟲夏草指標性蛋白方法，確定堿性梯度PAGE為最佳指標性蛋白IP4分離與制備方法，此時分離實驗條件為T=5

7、%~15%，恒壓140 v。進行堿性梯度PAGE割膠制備，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為冬蟲夏草及偽品21個指標性蛋白中的IP4，電透析法回收蛋白 IP4，回收率2.51%~3.27%；采用HPLC結(jié)合PAGE、IEF等方法鑒定其純度，達到后續(xù)實驗要求。
　　4．IP4多克隆抗體的制備與ELISA定量分析方法建立
　　將純化后蛋白IP4作為抗原免疫小鼠，得到多克隆抗體，測定其效價與特異性。進一步考察了IP4抗體ELISA檢測方法的最適條件：包

8、被液的選擇、抗原包被時間、封閉液的選擇與封閉時間、HRP酶標二抗的工作濃度、底物顯色時間等，建立ELISA測定冬蟲夏草多克隆抗體特異性方法。得到最佳包被液為 NBS，包被條件為37℃過夜，封閉液為1%PBSB，封閉時間為2 h，HRP酶標二抗工作濃度為1：3000，底物顯色時間為20 min。
　　對 ELISA定量分析方法進行特異性檢測，正品冬蟲夏草為陽性反應，偽品冬蟲夏草為陰性反應，表明該方法可定性鑒別冬蟲夏草；同時建立ELI

9、SA定量標準曲線，此時冬蟲夏草（四川雅家梗）蛋白中IP4含量為0.492 mg/mL占干藥材質(zhì)量的0.075%，占可溶性蛋白比例為3.71%，冬蟲夏草（西藏林芝）蛋白IP4含量為0.396 mg/mL，占干藥材質(zhì)量的0.063%，占可溶性蛋白3.22%，冬蟲夏草（青海西寧）蛋白IP4含量為0.421 mg/mL，占干藥材質(zhì)量的0.052%，占可溶性蛋白3.37%。不同產(chǎn)地間IP4含量有所不同，占干藥材質(zhì)量均大于0.05%，提示IP4可作