基于核酸信號(hào)放大技術(shù)的蛋白質(zhì)測(cè)定新方法研究.pdf

1、蛋白質(zhì)作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，它對(duì)于生命體和各種形式的生命活動(dòng)具有重要的意義，所以對(duì)重要蛋白質(zhì)的檢測(cè)日益成為焦點(diǎn)。然而生物傳感器所具備的檢測(cè)靈敏度高，并且能在復(fù)雜體系中準(zhǔn)確檢測(cè)目標(biāo)物的優(yōu)點(diǎn)為蛋白質(zhì)的檢測(cè)帶來(lái)新的發(fā)展方向。許多研究者致力于設(shè)計(jì)并研發(fā)新型的傳感器，從而可以快速、靈敏地檢測(cè)蛋白質(zhì)。
　　 核酸適配體作為一種功能性核酸，它主要是通過(guò)體外篩選技術(shù)——指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化法(systematic evolution of lig

2、ands by exponential enrichment，SELEX)篩選得到的DNA或RNA片段。篩選所得的核酸適配體可以特異性識(shí)別目標(biāo)物，如小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、金屬離子等，并且核酸適配體具有易于合成和修飾的優(yōu)點(diǎn)。隨著越來(lái)越多蛋白質(zhì)的核酸適配體被篩選出來(lái)，核酸適配體在以蛋白質(zhì)為分析模型的生物傳感器中得到廣泛的應(yīng)用。
　　 然而僅僅依靠核酸適配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合而引起信號(hào)的改變以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物靈敏檢測(cè)的作用是有限的。信號(hào)放大技

3、術(shù)對(duì)于提高實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的靈敏度有著顯著的作用。如今基于各種核酸放大技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物靈敏檢測(cè)的方法被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建中，如滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、切刻內(nèi)切酶放大技術(shù)、聚合酶擴(kuò)增放大技術(shù)等等。
　　 綜上所述，在查閱已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本文基于核酸放大技術(shù)構(gòu)建了一系列新型的生物傳感器用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)。具體的工作內(nèi)容如下:
　　 在第2章中構(gòu)建了一個(gè)基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大技術(shù)(HCR)和酶催化反應(yīng)的電化學(xué)傳感器，并將該傳感器用于γ-干

4、擾素的檢測(cè)。雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中含有兩個(gè)部分互補(bǔ)雜交的發(fā)夾探針，在引發(fā)鏈的誘導(dǎo)作用下這兩個(gè)發(fā)夾探針通過(guò)不斷地互補(bǔ)雜交以鏈置換方式打開(kāi)全部發(fā)夾，最終形成大量帶切口的長(zhǎng)雙螺旋DNA。被固定在電極表面的捕獲探針可與γ-干擾素的核酸適配體互補(bǔ)雜交。目標(biāo)蛋白與核酸適配體的作用使得γ-干擾素核酸適配體所在的識(shí)別探針無(wú)法被捕獲到電極表面，從而識(shí)別探針中引發(fā)鏈部分所誘發(fā)的HCR反應(yīng)產(chǎn)物無(wú)法連接和固定到電極表面。由于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大方法中所用的發(fā)夾探針的末端修

5、飾有生物素，則鏈酶親和素修飾的堿性磷酸酯酶可以通過(guò)生物素和鏈酶親和素的作用結(jié)合到電極表面HCR反應(yīng)產(chǎn)物上。堿性磷酸酯酶可催化非電化學(xué)活性的物質(zhì)1-萘酚磷酸鹽轉(zhuǎn)化為具有電化學(xué)活性的物質(zhì)1-萘酚，實(shí)現(xiàn)對(duì)體系中目標(biāo)物含量的檢測(cè)。
　　 第3章中利用切刻內(nèi)切酶介導(dǎo)的鏈置換放大技術(shù)檢測(cè)凝血酶。目標(biāo)物凝血酶與核酸適配體相結(jié)合引起適配體構(gòu)象的變化，從而使核酸適配體所在的RP發(fā)夾探針結(jié)構(gòu)改變，并釋放出其莖端部分的堿基，繼而與HP發(fā)夾探針的環(huán)狀部

6、分互補(bǔ)雜交。HP發(fā)夾探針被打開(kāi)之后，具有切刻內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的單鏈DNA可以和HP發(fā)夾探針部分雜交。在聚合酶和切刻內(nèi)切酶的作用下，產(chǎn)生大量與分子信標(biāo)互補(bǔ)的DNA，從而使得分子信標(biāo)的熒光恢復(fù)。除此之外，RP發(fā)夾探針與凝血酶的復(fù)合物在聚合酶作用下被置換下來(lái)，從而可以與新的HP發(fā)夾探針雜交形成循環(huán)效應(yīng)，以提高檢測(cè)的靈敏度。
　　 在第4章中基于氧化石墨烯可以猝滅熒光的性質(zhì)，運(yùn)用核酸外切酶Ⅲ酶切循環(huán)放大技術(shù)檢測(cè)溶菌酶。核酸外切酶Ⅲ在遇到單

7、鏈DNA和3'端突出4個(gè)以上堿基的雙鏈DNA時(shí)會(huì)失去酶切活性。溶菌酶的適配體所在的核酸鏈為3'端突出10個(gè)堿基的發(fā)夾探針。溶菌酶與適配體結(jié)合使發(fā)夾探針構(gòu)象發(fā)生改變，繼而熒光探針可以和發(fā)夾探針互補(bǔ)雜交并在熒光探針的3'端形成一個(gè)平齊末端。此時(shí)，外切酶Ⅲ可以將熒光探針切割成DNA片段，則發(fā)夾探針可以與新的熒光探針互補(bǔ)雜交，實(shí)現(xiàn)酶切循環(huán)。由于DNA片段不能被石墨烯吸附，則修飾在熒光探針的熒光基團(tuán)的熒光可以保持。通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的