基于核酸信號放大技術(shù)的蛋白質(zhì)測定新方法研究.pdf

1、蛋白質(zhì)作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，它對于生命體和各種形式的生命活動具有重要的意義，所以對重要蛋白質(zhì)的檢測日益成為焦點。然而生物傳感器所具備的檢測靈敏度高，并且能在復(fù)雜體系中準確檢測目標物的優(yōu)點為蛋白質(zhì)的檢測帶來新的發(fā)展方向。許多研究者致力于設(shè)計并研發(fā)新型的傳感器，從而可以快速、靈敏地檢測蛋白質(zhì)。
　　 核酸適配體作為一種功能性核酸，它主要是通過體外篩選技術(shù)——指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化法(systematic evolution of lig

2、ands by exponential enrichment，SELEX)篩選得到的DNA或RNA片段。篩選所得的核酸適配體可以特異性識別目標物，如小分子、蛋白質(zhì)、細胞、金屬離子等，并且核酸適配體具有易于合成和修飾的優(yōu)點。隨著越來越多蛋白質(zhì)的核酸適配體被篩選出來，核酸適配體在以蛋白質(zhì)為分析模型的生物傳感器中得到廣泛的應(yīng)用。
　　 然而僅僅依靠核酸適配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合而引起信號的改變以實現(xiàn)對目標物靈敏檢測的作用是有限的。信號放大技

3、術(shù)對于提高實驗檢測的靈敏度有著顯著的作用。如今基于各種核酸放大技術(shù)實現(xiàn)對目標物靈敏檢測的方法被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建中，如滾環(huán)擴增技術(shù)、切刻內(nèi)切酶放大技術(shù)、聚合酶擴增放大技術(shù)等等。
　　 綜上所述，在查閱已有文獻的基礎(chǔ)上，本文基于核酸放大技術(shù)構(gòu)建了一系列新型的生物傳感器用于蛋白質(zhì)的檢測。具體的工作內(nèi)容如下:
　　 在第2章中構(gòu)建了一個基于雜交鏈式反應(yīng)放大技術(shù)(HCR)和酶催化反應(yīng)的電化學(xué)傳感器，并將該傳感器用于γ-干

4、擾素的檢測。雜交鏈式反應(yīng)中含有兩個部分互補雜交的發(fā)夾探針，在引發(fā)鏈的誘導(dǎo)作用下這兩個發(fā)夾探針通過不斷地互補雜交以鏈置換方式打開全部發(fā)夾，最終形成大量帶切口的長雙螺旋DNA。被固定在電極表面的捕獲探針可與γ-干擾素的核酸適配體互補雜交。目標蛋白與核酸適配體的作用使得γ-干擾素核酸適配體所在的識別探針無法被捕獲到電極表面，從而識別探針中引發(fā)鏈部分所誘發(fā)的HCR反應(yīng)產(chǎn)物無法連接和固定到電極表面。由于雜交鏈式反應(yīng)放大方法中所用的發(fā)夾探針的末端修

5、飾有生物素，則鏈酶親和素修飾的堿性磷酸酯酶可以通過生物素和鏈酶親和素的作用結(jié)合到電極表面HCR反應(yīng)產(chǎn)物上。堿性磷酸酯酶可催化非電化學(xué)活性的物質(zhì)1-萘酚磷酸鹽轉(zhuǎn)化為具有電化學(xué)活性的物質(zhì)1-萘酚，實現(xiàn)對體系中目標物含量的檢測。
　　 第3章中利用切刻內(nèi)切酶介導(dǎo)的鏈置換放大技術(shù)檢測凝血酶。目標物凝血酶與核酸適配體相結(jié)合引起適配體構(gòu)象的變化，從而使核酸適配體所在的RP發(fā)夾探針結(jié)構(gòu)改變，并釋放出其莖端部分的堿基，繼而與HP發(fā)夾探針的環(huán)狀部

6、分互補雜交。HP發(fā)夾探針被打開之后，具有切刻內(nèi)切酶識別位點的單鏈DNA可以和HP發(fā)夾探針部分雜交。在聚合酶和切刻內(nèi)切酶的作用下，產(chǎn)生大量與分子信標互補的DNA，從而使得分子信標的熒光恢復(fù)。除此之外，RP發(fā)夾探針與凝血酶的復(fù)合物在聚合酶作用下被置換下來，從而可以與新的HP發(fā)夾探針雜交形成循環(huán)效應(yīng)，以提高檢測的靈敏度。
　　 在第4章中基于氧化石墨烯可以猝滅熒光的性質(zhì)，運用核酸外切酶Ⅲ酶切循環(huán)放大技術(shù)檢測溶菌酶。核酸外切酶Ⅲ在遇到單

7、鏈DNA和3'端突出4個以上堿基的雙鏈DNA時會失去酶切活性。溶菌酶的適配體所在的核酸鏈為3'端突出10個堿基的發(fā)夾探針。溶菌酶與適配體結(jié)合使發(fā)夾探針構(gòu)象發(fā)生改變，繼而熒光探針可以和發(fā)夾探針互補雜交并在熒光探針的3'端形成一個平齊末端。此時，外切酶Ⅲ可以將熒光探針切割成DNA片段，則發(fā)夾探針可以與新的熒光探針互補雜交，實現(xiàn)酶切循環(huán)。由于DNA片段不能被石墨烯吸附，則修飾在熒光探針的熒光基團的熒光可以保持。通過檢測熒光信號可以實現(xiàn)目標物的