異鼠李素對糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)及作用機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 異鼠李素對糖尿病腎病大鼠的腎臟保護(hù)作用
　　目的：
　　評估糖尿病腎病大鼠的腎損傷狀態(tài)，觀察不同劑量的異鼠李素干預(yù)對糖尿病大鼠腎臟腎損傷指標(biāo)和病理學(xué)改變的影響。
　　方法：
　　動物模型制備及分組
　　健康雄性SD大鼠45只，隨機(jī)分為正常對照組(NC組)10只和模型組35只，NC組給予正常飲食，模型組大鼠給予高脂飲食4周配合鏈脲佐菌素(30mg/kg)一次

2、性腹腔注射制備糖尿病大鼠模型，測外周隨機(jī)血糖連續(xù)三天超過16.7mmol/l的大鼠視為造模成功，成模后的大鼠隨機(jī)分為糖尿病組(DM組，n=11)，低劑量異鼠李素組（ISO-50組，n=11）和高劑量異鼠李素組（ISO-50組，n=10），ISO-50組和ISO-150組分別給予異鼠李素50mg/kg/d和150mg/kg/d灌胃，12周后留取24小時尿液及腎組織待檢。
　　腎臟損傷生物學(xué)指標(biāo)及病理學(xué)檢查
　　使用強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖

3、儀采用葡萄糖氧化酶法測量大鼠空腹血糖，全自動生化分析儀測24小時尿白蛋白，ELISA方法檢測尿骨橋蛋白和KIM-1水平，剝離雙側(cè)腎臟稱重，計算腎臟肥大指數(shù)(KI)，取腎皮質(zhì)行腎臟病理學(xué)檢查分別觀察光鏡和電鏡下大鼠腎臟病理改變。
　　統(tǒng)計方法
　　采用SPSS14.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行多組間比較，并進(jìn)行方差齊性檢驗，結(jié)果顯著

4、者采用Students-Newman-Keuls(SNK)進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.試驗動物入組情況
　　3只大鼠造模未成功，2只大鼠試驗過程中死亡，共有40只大鼠進(jìn)入實驗結(jié)果分析，其中NC組、DM組、ISO-50組和ISO-150組各10只。
　　2.大鼠腎臟肥大指數(shù)比較
　　與對照組相比，DM組、ISO-50組、ISO-150組KI明顯升高(P＜0.05)。而D

5、M組KI值明顯高于兩異鼠李素干預(yù)組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。ISO-50組和ISO-150組KI值無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.大鼠空腹血糖水平比較
　　DM、ISO-50和ISO-150三組大鼠的空腹血糖較NC組明顯升高(P＜0.05)，三組間無明顯差異(P＞0.05)。
　　4.大鼠腎損傷指標(biāo)比較
　　DM、ISO-50和ISO-150三組大鼠的24小時尿白蛋白、骨橋蛋白、KIM-1均較對

6、照組明顯升高(P＜0.05)，ISO-50和ISO-150兩組尿白蛋白、骨橋蛋白及KIM-1水平均較DM組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時ISO-150組又較ISO-50組明顯下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　異鼠李素能夠降低糖尿病大鼠腎臟肥大指數(shù)，減少尿白蛋白排泄，減輕腎損傷指標(biāo)，并改善大鼠腎臟病理組織學(xué)改變，延緩DN進(jìn)展。
　　第二部分 異鼠李素對糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激和NF-κB信號通路的影響
　　目的：

7、
　　觀察糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激水平、NF-κB信號通路活化狀態(tài)及炎癥因子的表達(dá)情況，評估不同劑量異鼠李素干預(yù)對氧化應(yīng)激、NF-κ出及炎癥因子表達(dá)的影響，同時體外試驗觀察異鼠李素對LPS誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激、NF-κB激活及炎癥反應(yīng)狀態(tài)的影響。
　　方法：
　　動物模型制備及分組同第二部分
　　系膜細(xì)胞培養(yǎng)及分組
　　體外培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對照組(NC組)，脂多糖組(LPS組)，低劑量異

8、鼠李素組（ISO-5組）和高劑量異鼠李素組（ISO-10組），ISO-5組和ISO-10組在LPS的基礎(chǔ)上分別加用異鼠李素5μmol/l和10μmol/l共同培養(yǎng)72小時。
　　氧化應(yīng)激狀態(tài)測定
　　黃嘌呤氧化酶法檢測腎組織勻漿及系膜細(xì)胞培養(yǎng)液中總超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性，同時比色法測定丙二醛(MDA)含量以評估氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　腎組織及系膜細(xì)胞NF-κB通路檢測
　　ELISA方法檢測腎組織勻漿及系

9、膜細(xì)胞裂解液中NF-κB p65、磷酸化NF-κBp65、IκBα、磷酸化IκBα水平及NF-κB p65DNA結(jié)合活性，RT-PCR法檢測NF-κB p65mRNA表達(dá)。
　　腎組織及系膜細(xì)胞炎癥因子檢測
　　ELISA及RT-PCR法檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1和TGF-β1的蛋白和mRNA表達(dá)。
　　統(tǒng)計方法
　　采用SPSS14.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用均值±

10、標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行多組間比較，并進(jìn)行方差齊性檢驗，結(jié)果顯著者采用Students-Newman-Keuls(SNK)進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.異鼠李素對氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響
　　1.1大鼠腎組織T-SOD活力及MDA水平比較
　　DM組腎組織T-SOD活力較NC組顯著下降(P＜0.05)，而MDA水平明顯升高（P＜0.

11、05），ISO-50組和ISO-150組大鼠的T-SOD活力較DM組均明顯升高(P＜0.05)，MDA水平顯著升高(P＜0.05)，與ISO-50組比較ISO-150組大鼠腎組織及系膜細(xì)胞中的T-SOD活力升高，同時MDA水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　1.2系膜細(xì)胞T-SOD活力及MDA水平比較
　　LPS組系膜細(xì)胞T-SOD活力較NC組顯著下降(P＜0.05)，而MDA水平明顯升高(P＜0.05)，IS

12、O-5組和ISO-10組系膜細(xì)胞的T-SOD活力較DM組均明顯升高(P＜0.05)，MDA水平下降(P＜0.05)，與ISO-5組比較ISO-10組系膜細(xì)胞中的T-SOD活力升高，同時MDA水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.異鼠李素對NF-κB信號通路激活水平影響
　　2.1糖尿病大鼠NF-κB信號通路激活水平的比較
　　DM組大鼠的NF-κB p65(蛋白和mRNA)、磷酸化NF-κB p65和

13、磷酸化IκBα均較NC組顯著升高(P＜0.05)，與DM組相比，ISO-50和ISO-150組的NF-κBp65(蛋白和mRNA)、磷酸化NF-κB p65和磷酸化IκBα水平均有明顯下降(P＜0.05)，且ISO-150組較ISO-50組又有顯著下降(P＜0.05)，各組大鼠腎組織IκBα水平無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.2系膜細(xì)胞NF-κB信號通路激活水平的比較
　　LPS組系膜細(xì)胞裂解液中NF-κB p65、磷

14、酸化NF-κB p65及磷酸化IκBα較NC組均顯著升高(P＜0.05)，ISO-5和ISO-10組的NF-κB p65(蛋白和mRNA)、磷酸化NF-κB p65及磷酸化IκBα水平較LPS組均有明顯下降(P＜0.05)，且ISO-10組較ISO-5組上述指標(biāo)又有顯著下降(P＜0.05)，各組系膜細(xì)胞IκBα水平均無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.3大鼠腎組織及系膜細(xì)胞NF-κB p65DNA結(jié)合活性比較
　　體內(nèi)試驗

15、中，DM組大鼠腎組織NF-κB p65DNA結(jié)合活性較NC組明顯升高(P＜0.05)，ISO-50和ISO-150組的NF-κB p65DNA結(jié)合活性較DM組顯著下降(P＜0.05)，且ISO-150組較ISO-50組又有顯著下降(P＜0.05);體外試驗中，LPS組系膜細(xì)胞NF-κB p65DNA結(jié)合活性較NC組明顯升高，異鼠李素同樣劑量依賴性降低了系膜細(xì)胞NF-κB p65的DNA結(jié)合活性。
　　2.4大鼠腎組織炎癥因子水平比

16、較
　　DM組大鼠腎組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1和TGF-β1的蛋白及mRNA水平均較NC組明顯升高(P＜0.05)，ISO-50和ISO-150組大鼠的各項炎癥因子蛋白及mRNA水平較DM組顯著降低，而ISO-150較ISO-50組又有明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.異鼠李素能夠劑量依賴性改善糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)，能顯著減輕LPS誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞氧

17、化應(yīng)激狀態(tài)，效果呈劑量依賴性。
　　2.糖尿病大鼠腎臟存在NF-κB系統(tǒng)的過度活化及炎癥因子表達(dá)增加;LPS能夠誘導(dǎo)大鼠系膜細(xì)胞NF-κB系統(tǒng)的過度激活及炎癥因子的表達(dá)水平增加，模擬炎癥狀態(tài)。
　　3.異鼠李素能夠劑量依賴性抑制糖尿病大鼠腎組織中NF-κB系統(tǒng)的過度活化，降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1和TGF-β1的蛋白和mRNA水平;能夠劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞NF-κB系統(tǒng)的過度