MeCP2-furin活化active-TGF-β促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化.pdf

1、目的：
　　檢測(cè)甲基化結(jié)合蛋白2（Methyl-CpG-binding Protein2, MeCP2）在三種胰腺癌細(xì)胞系（PANC1、PaTu8988、SW1990）的表達(dá)量。初步探索MeCP2對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響，并研究MeCP2在胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中作用的相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：
　　采用定量PCR及Western blot檢測(cè)MeCP2 mRNA和蛋白在PANC1、PaTu8988、SW

2、1990三種胰腺癌細(xì)胞株的表達(dá)水平。分別構(gòu)建干擾質(zhì)粒shMeCP2及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒3×flag MeCP2，在相對(duì)高表達(dá)細(xì)胞PANC1、PaTu8988中特異性干擾MeCP2的表達(dá)，在相對(duì)低表達(dá)細(xì)胞PaTu8988、SW1990中過(guò)表達(dá)MeCP2。上調(diào)或下調(diào)MeCP2， CCK8、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。Western blot檢測(cè)其對(duì)增殖蛋白（CDC20）、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白（E-c

3、adherin、Vimentin、α-SMA、snail）及侵襲蛋白（MMP2、MMP9）的影響。并運(yùn)用Western blot檢測(cè)TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白（Smad2/3、p-Smad2/3、TGF-β、TGF-βR、furin）表達(dá)量的變化。Furin inhibitor II抑制劑及質(zhì)粒 shfurin處理胰腺癌細(xì)胞， Western blot檢測(cè)TGF-β表達(dá)量的變化。采用免疫沉淀IP法檢測(cè)MeCP2與Smad2/3

4、/4是否結(jié)合，染色質(zhì)共沉淀法ChIP檢測(cè)Smad2/3/4與furin轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)是否結(jié)合。結(jié)果：
　　定量PCR法及Western blot顯示在三種胰腺癌細(xì)胞PANC1、PaTu8988、SW1990中，PANC1細(xì)胞中MeCP2蛋白、mRNA表達(dá)量最高，PaTu8988次之，SW1990最少。構(gòu)建干擾質(zhì)粒shMeCP2及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒3×flag MeCP2，驗(yàn)證并測(cè)序成功。在相對(duì)高表達(dá)細(xì)胞PANC1及PaTu8988中下調(diào)Me

5、CP2，其相對(duì)增值率、遷移及侵襲能力明顯下降(p<0.05)。Western blot檢測(cè)CDC20蛋白表達(dá)量降低，Vimentin、α-SMA、snail蛋白表達(dá)量降低，且細(xì)胞黏附分子E-cadherin蛋白量增多，定量PCR及Western blot檢測(cè)侵襲蛋白MMP2、MMP9 mRNA和蛋白表達(dá)水平下降(p<0.05)。在相對(duì)低表達(dá)細(xì)胞SW1990及PaTu8988中上調(diào)MeCP2，其相對(duì)增值率、遷移、侵襲能力明顯增強(qiáng)(p<0.

6、05)。Western Blot檢測(cè)CDC20蛋白表達(dá)量增多，Vimentin、α-SMA、snail蛋白表達(dá)量增多，且細(xì)胞黏附分子E-cadherin蛋白量降低，定量PCR及Western blot檢測(cè)侵襲蛋白MMP2、MMP9 mRNA和蛋白表達(dá)水平增加(p<0.05)。Western blot進(jìn)一步檢測(cè)了TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白Smad2/3、p-Smad2/3、TGF-β、TGF-βR表達(dá)量的變化，并發(fā)現(xiàn) furin

7、表達(dá)量也發(fā)生了明顯變化。下調(diào)MeCP2，總的Smad2/3無(wú)明顯變化(p>0.05)，p-Smad2/3明顯降低(p<0.05)；總的TGF-βR無(wú)明顯變化(p>0.05)，active-TGF-β（12.5 kDa）明顯降低，且furin蛋白、mRNA表達(dá)量明顯下降(p<0.05)。上調(diào)MeCP2，總的Smad2/3無(wú)明顯變化(p>0.05)， p-Smad2/3明顯增多(p<0.05)；總的TGF-βR無(wú)明顯變化(p>0.05)，a

8、ctive-TGF-β（12.5 kDa）明顯增多，且furin蛋白、mRNA表達(dá)量明顯增加(p<0.05)。Furin inhibitor II抑制劑及質(zhì)粒shfurin均能使active-TGF-β（12.5 kDa）表達(dá)明顯下降(p<0.05)。免疫沉淀IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MeCP2與Smad2/3/4結(jié)合，染色質(zhì)共沉淀法ChIP發(fā)現(xiàn)Smad2/3/4與furin轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　MeCP2差異性表達(dá)于3種