多重耐藥弗氏檸檬酸桿菌P10159和噬菌體IME-CF2的測序和基因組學研究.pdf

1、弗氏檸檬酸桿菌是人體腸道正常菌群，也是條件致病菌，能引起免疫力低下人群患病。弗氏檸檬酸桿菌自發(fā)現(xiàn)之初就表現(xiàn)出對常用的抗生素耐受，抗生素治療只能抑制其生長。此外，該菌對表面活性劑、化學消毒劑、紫外線照射等具有一定抵抗作用。因此，不易將其從醫(yī)療設備上清除干凈，是院內(nèi)感染重要病原菌之一，重要性僅次于銅綠假單胞菌。當前，抗生素藥物的研發(fā)速度遠遠趕不上細菌獲得耐藥的速度，耐藥細菌特別是多重耐藥病原菌給臨床抗感染治療帶來極大挑戰(zhàn)。臨床亟待尋找抗生素

2、可替代品，用于耐藥病原菌的防控和治療。有古老研究歷史的噬菌體治療此時展現(xiàn)出許多優(yōu)勢，是一種潛在治療方案，重新獲得人們的關注。
　　高通量測序技術（HTS），又叫下一代測序技術（NGS），具有通量高、速度快、價格低廉等優(yōu)點，為基因組學的發(fā)展提供了重要支撐，是生命科學和醫(yī)學等行業(yè)研究的重要工具?；蚪M完整序列的獲取對研究遺傳、進化、變異、基因組成、基因調(diào)控等具有重要意義。當前，市場主流的二代測序平臺有Roche454、Illumina

3、的 Hiseq及 Miseq、Life的 Ion Torrent。其中Illumina占據(jù)絕大部分市場，其突出優(yōu)點是通量高、準確度高。Ion Torrent測序速度最快，Roche454單條Reads序列讀長最長，它們都有同聚性錯誤的缺點。以上測序儀在不同的應用領域有其優(yōu)勢與不足。
　　本實驗針對分離于醫(yī)院食管癌患者尿液的一株多重耐藥弗氏檸檬酸桿菌，首先測定其耐藥譜和生化特性。然后，使用Ion Torrent對其進行全基因組測序研

4、究和基因組學分析。為解決基因組序列拼接中因重復序列所致斷裂問題，我們使用Shotgun和Mate-Pair兩種測序方法。序列組裝使用Newbler v2.8，由于其組裝原理基于序列相似性比對，過多數(shù)據(jù)反而不利于組裝。經(jīng)反復嘗試，我們推薦使用約30倍覆蓋倍數(shù)的數(shù)據(jù)用于組裝。ContigScape軟件用于Contigs關聯(lián)信息展示，并使用參考序列進行片段定位?；蚪MGap使用Gapfiller填補，針對其中不能填補的Gap，兩端設計引物，通

5、過PCR擴增獲取該Gap序列。最終，獲取C.freundii P10159基因組全序，長5080321bp, GC含量51.7％?；蚪M編碼4768個CDSs，24個rRNA和69個tRNA。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載其余三株弗氏檸檬酸桿菌（C.freundii CAV1741、C.freundii CAV1321和C.freundii CFNIH1）全基因組序列，與本測序菌株P10159進行比較基因組學分析。結果顯示，4株弗氏檸檬酸

6、桿菌同源性較高，同源區(qū)域較多。C.freundii P10159相較于其他三株基因組有一個大片段顛倒突變（2.4~3.2Mbp），與C.freundii CAV1231株同源性最高。進一步抽提以上四株弗氏檸檬酸桿菌蛋白序列，進行同源蛋白比對分析。4株弗氏檸檬酸桿菌之間共有同源基因3395個，表明它們之間具有相對較高的同源性。C.freundii P10159與C.freundii CAV1321、C.freundii CAV1741和C

7、.freundii CFNIH1分別具有3613、3606和3488個同源基因。C.freundii P10159具有最多的特有基因787個，與其他三株差別最大?；?個管家基因和1個16S rRNA序列進化樹分析顯示，上述四株弗氏檸檬酸桿菌處于同一進化分支，能與大腸桿菌及沙門氏菌分開。本文第二章成功從醫(yī)院污水中分離到一株弗氏檸檬酸桿菌毒性噬菌體IME-CF2，電鏡照片顯示該噬菌體呈典型的二十面體結構，具有一收縮的尾部，形態(tài)類似肌尾噬菌