生長分化因子-5誘導(dǎo)人脂肪基質(zhì)細(xì)胞成骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、外傷、腫瘤切除、先天畸形造成的頜骨缺損在臨床較常見，目前常采用自體骨移植、異體骨移植、異種骨移植、金屬及人工合成材料替代等治療方法，尚不能完全滿足臨床的需要。組織工程技術(shù)的發(fā)展為頜骨缺損的修復(fù)提供了新的途徑。種子細(xì)胞，生長因子和支架材料是組織工程的三大要素。近年來研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織中存在一些具有自我更新和多向分化潛能的脂肪基質(zhì)細(xì)胞（adipose derived stromal cells，ADSCs），這些細(xì)胞在一定條件下可分化為脂肪細(xì)

2、胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞，具有成骨、成脂、成軟骨、成肌肉、成神經(jīng)等多種潛能。而且脂肪組織還具有取材簡便、來源豐富等優(yōu)勢，被認(rèn)為是組織工程中最有前途的種子細(xì)胞。其中，ADSCs用于骨缺損的修復(fù)倍受關(guān)注。生長因子在ADSCs成骨分化中起關(guān)鍵作用。常用的骨生長因子有骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morplnogenetic proteins 2，BMP2），骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（bone morplaogenetic pr

3、oteins 7，BMP7），生長分化因子5（Growth differentiation factor 5，GDF-5），轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF），胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）等。GDF-5是轉(zhuǎn)化生長因子超家族、骨形態(tài)發(fā)生蛋白亞

4、家族中的一員，在軟骨發(fā)生和長骨發(fā)育中具有重要作用。目前研究主要集中于其促進(jìn)軟骨分化和形成，對于其促進(jìn)成骨分化和骨形成的作用，國內(nèi)外的研究較少。因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GDF-5誘導(dǎo)hADSCs向成骨細(xì)胞分化，并將誘導(dǎo)后的細(xì)胞復(fù)合納米羥基磷灰石/膠原/L-聚乳酸（nHAC/PLA）支架植入裸鼠體內(nèi)，構(gòu)建組織工程骨三維培養(yǎng)模型，并通過體內(nèi)體外研究觀察成骨情況，為其將來在頜骨組織工程中的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 全文共分為三部分：
　　

5、 第一部分：hADSCs分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究
　　 目的：研究hADSCs的生長特性、表面抗原特點(diǎn)，橫向分化潛能，在此基礎(chǔ)上對其進(jìn)行鑒定。
　　 方法：取健康人吸脂術(shù)中取出的新鮮脂肪組織，膠原酶消化法分離其中脂肪基質(zhì)細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)特征；MTT法測hADSCs的生長增殖狀況；流式細(xì)胞儀分析其表面抗原；波形絲蛋白、角蛋白免疫熒光染色鑒定其來源；在細(xì)胞鑒定基礎(chǔ)上礦化液誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，通過堿性磷酸酶染

6、色、OPN及Ⅰ型膠原免疫熒光染色、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色分析其成骨分化潛能；同時(shí)，采用成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞方向分化，油紅O染色進(jìn)行成脂分化鑒定。
　　 結(jié)果：原代及傳代培養(yǎng)的hADSCs形態(tài)均勻，呈類成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，生長能力旺盛；P3、P5、P10代hADSCs的增殖曲線大致相同，呈近似“S”形；P2代hADSCs表達(dá)CD29、CD44，CD105等問充質(zhì)細(xì)胞表面相對特異性標(biāo)志蛋白，CD14、CD45陰性表達(dá)；P4代hADSC

7、s免疫熒光染色波形絲蛋白陽性，角蛋白為陰性。成骨誘導(dǎo)21d后，堿磷酶染色、OPN、Ⅰ型膠原免疫熒光染色陽性，鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色表現(xiàn)為紅色結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)14d后油紅O染色有紅色著色的脂滴形成。
　　 結(jié)論：吸脂術(shù)來源的細(xì)胞具有未分化hADSCs的特征，在體外誘導(dǎo)條件下，可向成骨、成脂方向分化，具有橫向分化潛能。
　　 第二部分：GDF-5誘導(dǎo)hADSCs成骨分化作用的體外研究
　　 目的：研究GDF-5對hADSCs

8、體外成骨分化能力的影響。
　　 方法：將GDF-5分成0，1，10，100，500ng/ml 5個(gè)濃度，通過MTT法分析不同濃度GDF-5對hADSCs增殖的影響，通過堿性磷酸酶活性、茜素紅染色檢測GDF-5對其成骨分化能力的影響，確定GDF-5促進(jìn)成骨的最適濃度。然后取所確定的GDF-5濃度，分成對照組、礦化組、GDF-5三組，通過測定RT-PCR檢測成骨誘導(dǎo)后Runx2、OPN、Col I、VEGF基因的表達(dá)；western

9、 Blot檢測其成骨誘導(dǎo)后Runx2、OPN、Coll、VEGF蛋白的表達(dá)，分析該濃度GDF-5對P4代hADSCs的增殖、分化效應(yīng)。
　　 結(jié)果：100ng/ml為GDF-5促進(jìn)hADSCs成骨的最適濃度；三組培養(yǎng)基均能促進(jìn)hADSCs增殖，但GDF-5組促增殖作用顯著低于另兩組（P<0.05）；GDF-5組促成骨分化作用最為顯著，堿磷酶活性，Runx2、OPN、Coll、VEGF基因及蛋白的表達(dá)均高于礦化組和細(xì)胞組，統(tǒng)計(jì)學(xué)上

10、有顯著性差異（P<0.05）。
　　 結(jié)論：體外研究表明100ng/mlGDF-5有誘導(dǎo)hADSCs分化為成骨細(xì)胞的潛能。
　　 第三部分：GDF-5誘導(dǎo)hADSCs復(fù)合納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸體內(nèi)成骨的研究
　　 目的：觀察GDF-5誘導(dǎo)的hADSCs復(fù)合納米羥基磷灰石/膠原/L-聚乳酸裸鼠皮下成骨的能力
　　 方法：取對數(shù)生長期hADSCs，接種于納米羥基磷灰石/膠原/L-聚乳酸支架材料上，構(gòu)建細(xì)

11、胞/支架材料三維培養(yǎng)模型，掃描電鏡（SEM）觀察細(xì)胞在支架上的生長情況。然后，將其分別置于L-DMEM、礦化液、GDF-5體外培養(yǎng)一周后，移植入裸鼠背部皮下，4w、12w后取材，HE染色、Goldner's染色觀察支架材料復(fù)合體在裸鼠皮下成骨情況。
　　 結(jié)果：hADSCs能粘附在納米羥基磷灰石/膠原/L-聚乳酸（nanohydroxyapatite/collagen/L-poly lactic acid，nHAC/PLA）支架