達(dá)比加群對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的人氣道平滑肌細(xì)胞外基質(zhì)沉積的影響及機(jī)制探討.pdf

1、Huber和Koessler在九十多年前對(duì)致死性哮喘的經(jīng)典描述中首次提出了氣道重塑的概念。臨床上，氣道重塑是引起哮喘患者出現(xiàn)不可逆性通氣功能障礙的罪魁禍?zhǔn)住?br>　　研究表明，增厚的氣道平滑肌(ASM)層是引起哮喘患者產(chǎn)生氣流受限的首要原因。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在正常氣道內(nèi)起物理支撐作用，哮喘中氣道平滑肌細(xì)胞(ASMC)異常分泌的ECM不僅會(huì)加劇氣道狹窄，還會(huì)反向促進(jìn)ASMC異常增殖及分泌，形成氣道重塑的惡性循環(huán)。因此，ASMC分泌E

2、CM是哮喘氣道重塑防治的重要靶點(diǎn)。
　　肺內(nèi)凝血是近年哮喘防治的研究熱點(diǎn)。凝血系統(tǒng)中的關(guān)鍵蛋白酶凝血酶可以通過與特定的受體結(jié)合，發(fā)揮促炎、促增殖、促遷移等非凝血功能。凝血酶受體（PARs）中PAR-1與PAR-2在肺損傷及炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，以PAR-1關(guān)系尤為密切。PAR-1在氣道多種結(jié)構(gòu)細(xì)胞如肺成纖維細(xì)胞、ASMC、上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上均有表達(dá)。目前尚未有報(bào)道表明凝血酶-PAR-1對(duì)氣道ECM重塑的影響。
　　達(dá)比加

3、群酯是一種新型高效的直接凝血酶抑制劑，是最前沿的口服抗凝藥物?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)比加群對(duì)凝血酶-PAR1介導(dǎo)的非凝血功能同樣具有抑制作用。
　　據(jù)此，我們推測(cè)凝血酶可能通過與ASMC胞膜上的PAR-1結(jié)合，激活下游ERK1/2信號(hào)通路，促進(jìn)ECM沉積;而達(dá)比加群可以抑制這一效應(yīng)。
　　目的:
　　1.分離培養(yǎng)原代人氣道平滑肌細(xì)胞并進(jìn)行鑒定;
　　2.明確凝血酶對(duì)ASMC ECM沉積的作用;觀察PAR-1受體抑制劑S

4、CH79797及ERK1/2信號(hào)通路抑制劑U0126對(duì)這一作用的影響;
　　3.明確凝血酶對(duì)ASMC ERK1/2信號(hào)通路磷酸化水平的影響;觀察SCH79797及U0126對(duì)這一作用的影響;
　　4.明確達(dá)比加群干預(yù)凝血酶后，ASMC ECM沉積及ERK1/2信號(hào)通路磷酸化水平的變化。
　　方法:
　　1.取南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院胸外科肺葉切除術(shù)患者標(biāo)本，采用本課題組成熟的組織塊貼壁法分離培養(yǎng)原代人氣道平滑肌細(xì)胞。

5、采用特異性免疫熒光染色技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　2.選擇RT-PCR及Western blot技術(shù)分別檢測(cè)不同干預(yù)后ASMC ECM基因及蛋白的表達(dá)水平。
　　3.選擇Western blot技術(shù)檢測(cè)不同干預(yù)后ASMC ERK1/2的磷酸化水平變化。
　　4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):SPSS20.0軟件統(tǒng)計(jì)，采用One-Way ANOVA法進(jìn)行分析，確定方差齊且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后采用LSD法進(jìn)行多重比較。P＜0.05，差異即有統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)原代人氣道平滑肌細(xì)胞在光鏡下呈長(zhǎng)梭形，生長(zhǎng)融合后呈現(xiàn)“峰谷征”;經(jīng)抗α-SMA抗體進(jìn)行特異性染色后，可見胞質(zhì)內(nèi)均勻分布綠色熒光。
　　(2)①用遞增濃度的凝血酶(0.1-10U/ml)刺激細(xì)胞24h，COL-Ⅰα1的表達(dá)均顯著增加(P＜0.01)，1.0U/ml達(dá)最大效應(yīng);②用1.0U/ml的凝血酶刺激細(xì)胞不同時(shí)間(12-72h)，COL-Ⅰα1的表達(dá)均顯著增加(P＜0.01)，并在48

7、h到達(dá)峰值;③用凝血酶(1.0U/ml)刺激細(xì)胞12h，COL-Ⅰα1、多功能蛋白聚糖、纖連蛋白mRNA表達(dá)均顯著增加(P＜0.01)，而膠原蛋白Ⅲ、層黏連蛋白α1、α2mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異;④SCH79797及U0126均能顯著抑制凝血酶誘導(dǎo)的COL-Ⅰα1(P＜0.01)及ECM基因(P＜0.05)的表達(dá)增加。
　　(3)①凝血酶(1.0U/ml)刺激細(xì)胞不同時(shí)間(5-60min)，ERK1/2磷酸化水平顯著上升

8、(P＜0.05)，呈早期快速磷酸化模式，5min達(dá)最大效應(yīng);②SCH79797及U0126均能顯著抑制凝血酶誘導(dǎo)的ERK1/2快速磷酸化(P＜0.01)。
　　(4)達(dá)比加群提前干預(yù)細(xì)胞30min后，與對(duì)照組相比，能顯著抑制凝血酶誘導(dǎo)的COL-Ⅰα1(P＜0.01)、ECM基因(P＜0.05)的表達(dá)增加、并能抑制凝血酶誘導(dǎo)的ERK1/2快速磷酸化（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.采用組織塊貼壁法可成功分離培養(yǎng)出原