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文檔簡介
1、遺傳性痙攣性截癱(Hereditary spastic paraplegia,HSP)是一種在臨床上較為罕見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,具有明顯的遺傳和臨床異質(zhì)性。其主要臨床癥狀為對稱性雙側(cè)下肢漸進性肌無力和肌張力增高。病理學變化包括軸索變性和脫髓鞘,并可伴有神經(jīng)元缺失等改變。有關HSP的發(fā)病機制目前尚不明確,因此確定HSP的致病基因并對其功能進行研究就成為探索HSP發(fā)病機制及防治的關鍵。截至目前,已有70余個HSP致病基因位點和59個致病基
2、因被確定。其中,SPG42致病基因SLC33A1是由本課題組利用連鎖分析的方法從一例青島地區(qū)HSP家系中發(fā)現(xiàn)的。通過突變分析發(fā)現(xiàn)該家系患者SLC33A1基因第339位胸腺嘧啶突變?yōu)轼B嘌呤,引起SLC33A1蛋白第113位絲氨酸被精氨酸替代,此種錯義突變導致HSP發(fā)病。
為了更加有效的研究SLC33A1基因錯義突變引起遺傳性痙攣性截癱的作用機制,本課題小組構建Slc33a1 S113R錯義突變(Slc33a1SH3R)基因敲入小
3、鼠模型。前期研究發(fā)現(xiàn),雜合子小鼠(Slc33a1wt/mut)能正常存活,而純合子小鼠(Slc33a1wt/wt)在胚胎發(fā)育早期便死亡。這表明SLC33A1蛋白對Slc33a1S113R基因敲入小鼠早期胚胎發(fā)育至關重要。此外,我們對Slc33a1wt/mut突變小鼠脊髓灰質(zhì)區(qū)進行透射電鏡檢查,結果顯示Slc33a1wt/mut突變小鼠神經(jīng)細胞超微結構異常,出現(xiàn)退行性病變。尤其是線粒體,出現(xiàn)腫脹、局部空化、嵴缺失等形態(tài)異常。上述結論提示我
4、們Slc33a1基因?qū)€粒體的形態(tài)及功能維持具有重要作用。因此,我們利用SPG42患者及對照正常人的皮膚成纖維細胞,高表達野生型及突變Slc33a1的HeLa細胞,體外培養(yǎng)野生型和Slc33a1S113R基因敲入小鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞,研究Slc33a1S113R錯義突變對線粒體表型的影響,并對其作用機制進行了初步探討。
線粒體作為細胞內(nèi)的“動力工廠”,是機體內(nèi)最主要的能量供應者,可以為體內(nèi)神經(jīng)元細胞正常生命活動持續(xù)穩(wěn)定的提供
5、能量,因此確保線粒體結構和功能正常對神經(jīng)元存活至關重要。線粒體多呈短棒狀、粒狀或者線狀,而Slc33a1wt/mut突變小鼠脊髓灰質(zhì)區(qū)透射電鏡結果顯示神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中線粒體出現(xiàn)腫脹、局部空化和嵴缺失等形態(tài)異常。另外,從體外細胞水平上,對培養(yǎng)6天的小鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞進行軸突特異性標記物Tau蛋白免疫熒光染色,結果發(fā)現(xiàn)Slc33a1wt/mut突變小鼠大腦皮層神經(jīng)元部分軸突發(fā)生腫脹。同時向大腦皮層神經(jīng)元細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染線粒體表達載體pD
6、sRed2-Mito,觀察發(fā)現(xiàn)Slc33a1wt/mut突變小鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞中部分軸突腫脹是由于線粒體堆積造成的。隨后,對兩種基因型神經(jīng)元細胞軸突中線粒體運輸能力進行檢測,發(fā)現(xiàn)Slc33a1wt/mut突變小鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞線粒體的運輸能力出現(xiàn)了明顯下降,這說明Slc33a1S113R錯義突變對線粒體的影響在單細胞水平就能發(fā)生,并且是影響線粒體在神經(jīng)元軸漿中的運輸,造成了線粒體的堆積,進而影響線粒體對神經(jīng)元細胞的能量供應。但是
7、通過大腦皮層神經(jīng)元細胞α-Tubulin免疫熒光染色,并未發(fā)現(xiàn)二者的細胞骨架有明顯異常。說明Slc33a1S113R錯義突變不是通過影響細胞骨架進而影響軸漿運輸?shù)摹?br> 在體內(nèi)實驗中,我們向小鼠腓腸肌注射霍亂毒素B亞單位(Cholera Toxin BSubunit, CTB),對小鼠體內(nèi)逆行軸漿運輸能力進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)Slc33a1wt/mut突變小鼠軸漿內(nèi)物質(zhì)逆行性運輸出現(xiàn)異常。
此外,我們利用JC-1熒光探針檢測
8、了不同基因型細胞的線粒體膜電位水平。發(fā)現(xiàn)與對照組相比,Slc33a1wt/mut突變小鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞和SPG42患者皮膚成纖維細胞中線粒體膜電位水平明顯低于對照組,證明了Slc33a1S113R錯義突變能夠?qū)е戮€粒體功能發(fā)生異常。
另外,我們還對不同基因型細胞中ATP濃度進行了檢測。發(fā)現(xiàn)與對照組相比,SPG42患者皮膚成纖維細胞的ATP濃度明顯降低,說明Slc33a1S113R錯義突變導致線粒體ATP合成能力受到影響。<
9、br> 為了進一步探究SLC33A1是如何影響線粒體形態(tài)和功能的,我們首先對SLC33A1的亞細胞定位進行研究。
已有文獻報道,SLC33A1是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ac-CoA的轉(zhuǎn)運體,可參與多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的乙?;揎椷^程進而影響其生物學功能的維持,如APP切割蛋白BACE1、低密度脂蛋白受體LDLR和自噬相關蛋白ATG9A等。通過免疫熒光共定位分析,我們首次確認SLC33A1不僅定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),還部分定位于線粒體上。因此,我們推測
10、SLC33A1參與線粒體相關蛋白的乙?;揎椷^程,從而影響了其功能的維持。
綜上所述,我們確定Slc33a1S113R基因敲入雜合子小鼠脊髓神經(jīng)元細胞中線粒體形態(tài)異常。并且Slc33a1S113R錯義突變引起線粒體軸漿運輸異常,導致神經(jīng)元軸突中線粒體堆積,造成軸突的腫脹。此外,線粒體膜電位及ATP合成能力受到影響。通過免疫熒光共定位,確定SLC33A1在細胞內(nèi)與線粒體存在部分共定位情況。以上研究為進一步認識SLC33A1的功能
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