妊娠期陰道微生物群落的分布特點(diǎn)與GDM孕婦妊娠結(jié)局的相關(guān)性分析.pdf

1、目的：
　　1.孕期陰道不同部位的菌群特征差異分析
　　2.不同孕周陰道菌群的特征分析;
　　3.GDM孕婦陰道菌群結(jié)構(gòu)多樣性及與不良妊娠的關(guān)系。
　　方法：
　　第一部分
　　病例入組:隨機(jī)選擇就診本院產(chǎn)科門(mén)診的育齡期孕婦，年齡范圍20.1～38.2歲。樣本采集前30天內(nèi)未服用抗生素或抗真菌藥物，采集樣品前48小時(shí)內(nèi)無(wú)性生活，無(wú)陰道沖洗和/或局部用藥。共有34例孕婦入組。
　　樣本采集:所有病

2、例均由一位醫(yī)生負(fù)責(zé)完成檢查和樣本采集。婦產(chǎn)科醫(yī)生使用無(wú)菌窺陰器撐開(kāi)陰道，用無(wú)菌陰道拭子分別于宮頸(Cervix，C)、后穹窿(Posteriorfornix，P)、陰道下1/3(Vaginal canal，V)三個(gè)部位采集樣品。
　　實(shí)驗(yàn)流程:提取細(xì)菌基因組總DNA，使用細(xì)菌16S通用引物，擴(kuò)增陰道拭子樣品的16S rRNA V46保守區(qū)，將總PCR產(chǎn)物進(jìn)行PE101-bp測(cè)序，并獲取分類(lèi)操作單元（Operational-Taxo

3、nomic-Units，OTUs）。對(duì)其進(jìn)行分類(lèi);最后獲取樣品的α-多樣性、β-多樣性、同時(shí)根據(jù)UniFrac距離得到OTUs系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。尋找組與組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker，并進(jìn)行進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　第二部分
　　病例入組:選擇不同孕期的孕婦，分為孕中期(18.2±2.0w)和孕晚期(32.3±2.7w)與非孕期(NP)。
　　第三部分
　　研究對(duì)象:GDM組:在南方醫(yī)院婦產(chǎn)科門(mén)診首次進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)科檢

4、查，年齡范圍19.4～39.2歲，平均28.5±3.7歲。孕16～20周，納入志愿者共340人。由婦科醫(yī)生行常規(guī)檢查，將無(wú)臨床其他癥狀或指證的陰道疾病的患者納入研究范圍。入組標(biāo)準(zhǔn):①樣本采集前30天內(nèi)未服用抗生素或抗真菌藥物，采集樣品前48小時(shí)內(nèi)無(wú)性生活，無(wú)陰道沖洗和/或局部用藥;②本次妊娠前無(wú)高血壓、腎臟、心血管、肝臟、血液病等疾患者;③未曾服用過(guò)可能干擾糖、脂代謝藥物者（如消炎痛、酚妥拉明、速尿、噻唑類(lèi)利尿劑、苯妥英鈉、可的松等）;

5、④未合并內(nèi)分泌疾?。ㄈ缂卓骸⒓诇p、柯興氏綜合征）;⑤不吸煙、不飲酒者;⑥單胎妊娠、漢族。
　　GDM診斷標(biāo)準(zhǔn):空腹血糖≥5.1 mmol/L，餐后1小時(shí)血糖≥10.0mmol/L，餐后2小時(shí)血糖≥8.5mmol/L。結(jié)果有1項(xiàng)或以上達(dá)到或超過(guò)正常值，即診斷為GDM。對(duì)照組:同期就診南方醫(yī)院產(chǎn)科門(mén)診產(chǎn)前檢查的孕產(chǎn)婦，排除GDM，其他入組條件均同GDM組。
　　樣本采集:采集后穹窿的分泌物。
　　實(shí)驗(yàn)流程:同第一部分和第二

6、部分。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.1孕婦生殖道菌群總體結(jié)構(gòu)
　　乳酸桿菌(Lactobacillus spp.)是陰道菌群中最主要的組成成分，而阿托波菌屬，梭形桿菌屬，加德納菌屬，霍氏菌屬，普氏菌屬，鏈球菌屬所占的比例較小。在乳桿菌屬中，我們主要觀察到可以分為四亞類(lèi)，分別是卷曲乳桿菌(L.crispatus)，格氏乳桿菌(L.gasseri)，惰性乳酸桿菌（L.iners）和詹氏乳桿菌（L.jesseni

7、i）。
　　1.2孕婦生殖道三大采樣部位在“門(mén)”水平、“屬”水平菌群結(jié)構(gòu)無(wú)差異
　　孕婦生殖道菌群主要由厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）組成。其中厚壁菌門(mén)比例達(dá)80％以上。三大采樣部位宮頸(Cervix，C)、后穹窿(Posterior fornix，P)、陰道下1

8、/3(Vaginal canal，V)菌屬在“門(mén)”水平構(gòu)成無(wú)顯著差異。而“屬”水平的研究發(fā)現(xiàn)，孕婦生殖道菌群主要由乳酸桿菌（Lactobacillus）組成，其比例達(dá)60％，其次是加德納菌(Gardnerella)、鏈球菌(Streptococcus)、奇異菌屬(Atopobium)、普氏菌屬（Prevotella）等。但是，三大采樣部位宮頸(Cervix，C)、后穹窿(Posterior fornix，P)、陰道下1/3（Vagina

9、l canal，V）菌屬在“屬”水平構(gòu)成無(wú)顯著差異。
　　1.3孕婦生殖道三大采樣部位α-多樣性無(wú)差異
　　生殖道菌群alpla-多樣性兩大指標(biāo)Shannon index和PD whole tree評(píng)估三個(gè)采樣部位的菌屬多樣性的差異。我們采用了K個(gè)對(duì)立樣品的秩和檢驗(yàn)，結(jié)果顯示:無(wú)論是Shannon指數(shù)還是PD whole tree，三個(gè)部位alpha多樣性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　第二部分
　　2.1不同孕周的生殖道

10、菌群結(jié)構(gòu)特征及菌型(CST)分布情況
　　女性生殖道菌群孕中期(18.2±2.0w)和孕晚期(32.3±2.7w)與非孕期(NP)生殖道菌群結(jié)構(gòu)相似度高，主要以乳酸桿菌（Lactobacillus spp.）為優(yōu)勢(shì)菌，比例達(dá)80％以上。孕早期(9.0±2.6w)和產(chǎn)后期(7.0±0.3w)生殖道菌群呈現(xiàn)特征性菌群結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為厭氧菌如:加德納菌（GardnerelIa）、鏈球菌(Streptococcus)、奇異菌屬(Atopobi

11、um)、普氏菌屬（Prevotella）、霍氏菌屬（Hallella）等比例增加。我們的數(shù)據(jù)可將陰道菌群分成四種菌型（Communitystate types，CSTs）。CSTⅠ以卷曲乳桿菌（三.crispatus）為主導(dǎo)，CSTⅡ以格氏乳桿菌（L.gasseri）為主導(dǎo)，CSTⅢ則以惰性乳桿菌（L.iners）為主要組成成分，CSTⅣ-A主要由少量的加德納菌（Gardnerella），奇異菌屬(Atopobium)，鏈球菌屬（Str

12、eptococcus），普氏菌屬（Prevotella）和霍氏菌屬(Hallella)。
　　2.2不同孕周的生殖道菌群β多樣性
　　我們通過(guò)加權(quán)的UniFrac距離(weighted UniFrac distance)展示了生殖道菌群β多樣性。NP期、T2期和T3期的樣品均緊緊聚集在一起，分布較集中，相似度高。而T1期分布較離散，其離散度較T2，T3更大，表明T1期菌群多樣性增加。而產(chǎn)后組的微生物菌群分布明顯不同于其他各組

13、，離散度最大，體現(xiàn)產(chǎn)后期生殖道菌群的獨(dú)特性。
　　2.3不同孕周的生殖道菌群α多樣性
　　我們又進(jìn)一步分析了不同孕周的Shannon多樣性指數(shù)，與其他四組(NP非孕組，T1孕早期，T2孕中期，T3孕晚期）相比，T1期和產(chǎn)后組(PP) Shannon多樣性指數(shù)顯著增高，尤以產(chǎn)后組最高。
　　第三部分
　　3.1 GDM陰道菌群heatmap聚類(lèi)及陰道菌群特征
　　我們將所有的樣品陰道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行heatmap

14、（熱圖）聚類(lèi)分析，用菌型（Community state type，CST）來(lái)描述陰道菌群結(jié)構(gòu)的分類(lèi)。陰道菌群主要分為五大型(CSTⅠ-Ⅴ)，其中有四型屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus spp.），它們分別是:L.crispatus(CSTⅠ,39.1％)、 L.gasseri(CSTⅡ,3.9％)、L.iners(CSTⅢ,36.3％)和L.jensenii(CST V,4.5％)。CSTⅣ又可以分為兩大亞類(lèi): CSTⅣ-A

15、(14.7％)和CSTⅣ-B(1.5％)。CSTⅣ-A的菌屬主要包括:Gardnerella（加德納菌屬）、Anaerococcus（氣球菌屬）、Corynebacterium（棒狀桿菌屬）、Finegoldia（達(dá)芬戈?duì)柕戮treptococcus（鏈球菌）、Atopobium（奇異菌屬）、Prevotella（普氏菌屬）、Parvimonas（微單胞菌屬）、Sneathia（纖毛菌屬）、Mobiluncus（動(dòng)彎桿菌屬）和Pe

16、ptoniphilus（吲哚嗜胨菌）。CSTⅣ-B的特征是Atopobium（變異菌屬）占主要優(yōu)勢(shì)菌，同時(shí)伴有CSTⅣ-A的多樣性菌屬。另外，我們發(fā)現(xiàn)GDM組并未呈現(xiàn)某種特征性菌型分布，而是散在分布，與非GDM組不能區(qū)分。
　　3.2 GDM陰道菌群alpha多樣性
　　評(píng)估菌群alpha多樣性有四大指標(biāo)，分別為:Shanon指數(shù)、PD whole tree、Observed species、Chaol。結(jié)果顯示，GDM組與

17、非GDM組在Shanon指數(shù)、PDwhole tree、Observed species、Chaol四大指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，說(shuō)明了GDM陰道菌群菌屬的豐富度和和均度相似。
　　3.3 GDM陰道菌群的影響因素
　　我們采用Pearson距離和展示可能與GDM相關(guān)的因素。無(wú)論是菌型(CSTs)、孕周(Trimester)、pH、孕前BMI(Pre-BMI)都未能呈現(xiàn)特征性分布。結(jié)果表明，上述因素與GDM尚未發(fā)現(xiàn)