基于血腦屏障Claudins基因調控的冰片、麝香酮-開竅-機制研究及安全性評價.pdf

1、目的:研究中藥開竅藥冰片和麝香酮對斑馬魚血腦屏障超微結構及其緊密連接蛋白Claudins表達的影響,以闡明冰片和麝香酮開啟血腦屏障的機制。利用斑馬魚胚胎對冰片和麝香酮的安全性進行評價。
　　方法:給成年斑馬魚腹腔注射麝香酮(給予冰片后血腦屏障超微結構的觀察之前的研究者已做過),利用透射電子顯微鏡觀察血腦屏障超微結構的變化;實時熒光定量PCR和整體原位雜交技術探討冰片和麝香酮對斑馬魚緊密連接蛋白Claudins表達的影響以及下調明顯

2、基因不同時間點表達的變化。受精后3h(3hpf)斑馬魚在含冰片和麝香酮不同濃度的胚胎養(yǎng)殖水液暴露,在8,24,48,72和96hpf用顯微鏡觀察胚胎發(fā)育形態(tài),測定24hpf自主抽動次數(shù),48hpf心率、孵化率、畸形率和死亡率,RT-qPCR法檢測96hpf胚胎sepn1基因表達的情況。
　　結果:在給予麝香酮后,BBB的基膜出現(xiàn)斷裂,膨大的現(xiàn)象,緊密連接結構疏松,內皮細胞出現(xiàn)皺縮,隨著給藥時間的增長,BBB疏松越明顯(與冰片結果一

3、致);冰片或麝香酮作用1h后,大部分基因表達下調,其中Claudin-5a,-12在冰片中下調明顯,Claudin-2,-5a,-7b在麝香酮中下調明顯。Claudin-5a在冰片作用后,1h下調最為明顯,6h后表達恢復。麝香酮作用的4h之間,Claudin-2,-5a,-7b表達先短暫上調,后下調,1h下調最顯著,然后又恢復,其中Claudin-5a在4h時恢復至正常水平。冰片和麝香酮對斑馬魚胚胎24hpf時自主抽動次數(shù),48hpf心

4、率,孵化率,畸形率,死亡率都存在不同程度的影響;48hpf以后都出現(xiàn)脊柱彎曲、心囊水腫、卵黃囊水腫,游泳異常的毒性癥狀;冰片使胚胎的sepn1基因表達上調(P<0.05)。麝香酮使 sepn1基因表達明顯下調(p<0.01)。
　　結論:冰片和麝香酮能使緊密連接蛋白Claudins家族基因表達下調,致使緊密連接結構疏松,加之基膜結構破壞,內皮細胞皺縮,使得血腦屏障的屏障作用減弱,從而開啟血腦屏障。基因可逆性的下調說明冰片和麝香酮對