我國深圳地區(qū)HIV分子流行病學(xué)調(diào)查及優(yōu)勢毒株感染性克隆的制備.pdf

1、第一部分深圳地區(qū)HIV分子流行病學(xué)調(diào)查
　　1992年，深圳發(fā)現(xiàn)首例HIV陽性感染者。隨后深圳市報(bào)告的HIV/AIDS病例數(shù)呈現(xiàn)逐年上升趨勢，年平均增長率高達(dá)24.7%；病例感染途徑亦不斷發(fā)生變化，由早期的IDU傳播轉(zhuǎn)變?yōu)橐孕詡鞑橹?，HIV感染呈現(xiàn)出從高危人群向普通人群快速擴(kuò)散的態(tài)勢。艾滋病的出現(xiàn)以及快速傳播成為深圳市重要的公共衛(wèi)生問題。鑒于深圳市存在大量非戶籍人口，人員流動頻繁、人口結(jié)構(gòu)復(fù)雜，迫切需要對其進(jìn)行艾滋病分子流行病學(xué)

2、調(diào)查，以闡明其HIV流行模式。
　　目的：對深圳地區(qū)傳播的HIV進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，了解HIV流行趨勢。
　　方法：采用隨機(jī)數(shù)字法挑選深圳地區(qū)2015年新確認(rèn)HIV感染者作為研究對象，收集人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息；利用核酸提取試劑盒獲取樣本基因組，采用逆轉(zhuǎn)錄/巢式PCR的方法擴(kuò)增HIVgag、pol基因片段，擴(kuò)增片段純化后測序并進(jìn)行序列拼接；將各片段基因序列提交Los Alamos HIV Databases，分析亞型并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化

3、樹；擴(kuò)增、測定URF病毒全長序列并進(jìn)行重組分析；將深圳序列與全國序列比對后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行溯源分析；pol基因序列提交斯坦福大學(xué)耐藥數(shù)據(jù)庫檢測耐藥位點(diǎn)；利用HCV酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣本中HCV抗體存在情況；將深圳地區(qū)2015年HIV流行狀況與2013年進(jìn)行比較，了解深圳HIV的流行變化；采用系統(tǒng)進(jìn)化的方法對HES感染人群中的MSMs進(jìn)行甄別研究。
　　結(jié)果：隨機(jī)法獲得深圳市2015年新報(bào)告HIV感染者250例，其中88.4%為

4、男性感染者；感染者年齡以青壯年為主，其中15~29歲人群高達(dá)49.2%；96.8%感染者傳播方式為性傳播，其中MSM占52%。主要傳播亞型為CRF01_AE，CRE07_BC，CRF55_01B，分別占31.96%，37.90%，10.50%；URF比例較高，占7.76%。獲得的樣本中耐藥率為2.8%，HIV與HCV共感染人數(shù)僅7人（2.8%）。溯源分析發(fā)現(xiàn)深圳樣本中，CRF01_AE亞型中的HESs與MSMs分別形成單獨(dú)的流行簇，與全

5、國CRF01_AE的流行簇相重合，而CRF07_BC則無明顯流行簇出現(xiàn)。與2013年本室獲得的深圳市HIV分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較時發(fā)現(xiàn)15~29歲感染者在2015年明顯增加，差異性統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)顯示P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2013年和2015年流行亞型均為CRF01_AE、CRF07_BC、CRF55_01B，各亞型所占比例無明顯變化。耐藥率2013年與2015年分別為0.8%和2.8%；與HCV共感染人數(shù)分別為23人（9.2%）和

6、7人（2.8%），主要人群均集中在IDU或HES中男性人群。溯源分析中2013年與2015年差別不大，CRF07_BC不聚集成簇，CRF01_AE存在單獨(dú)的MSMs流行簇和HESs流行簇。利用系統(tǒng)進(jìn)化樹分析甄別了深圳感染CRF01_AE的HES男性感染者中約有11%的人是由于男男同性性行為感染HIV。結(jié)論：深圳地區(qū)HIV主要在男性性傳播人群中擴(kuò)散，感染者年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢；HIV感染亞型分布的明顯多樣，URF比例高，流行狀況復(fù)雜；因?yàn)樘?/p>

7、殊的社會、文化背景，深圳地區(qū)部分MSM人群在現(xiàn)場調(diào)查中不愿暴露其男男性行為方式。
　　第二部分深圳地區(qū)優(yōu)勢HIV毒株（CRF01_AE）感染性克隆的構(gòu)建
　　1994年我國發(fā)現(xiàn)第一例CRF01_AE毒株后，該毒株快速傳播，目前已經(jīng)成為我國大部分地區(qū)的（除了西南地區(qū)）主要流行亞型。在一些省份，超過80%的新報(bào)告病例為CRF01_AE感染。由于性傳播造成的感染不斷增加，CRF01_AE亞型在全國HIV感染者中所占比例也不斷增加。

8、在深圳地區(qū)，CRF01_AE也是主要流行亞型之一，因此對CRF01_AE流行病學(xué)和發(fā)病機(jī)理的研究刻不容緩。感染性克隆不僅是確定特定基因生物學(xué)效應(yīng)的有力工具，更是研究病毒致病基因與人體免疫反應(yīng)的有效手段。因此構(gòu)建CRF01_AE病毒的感染性克隆對于深入研究CRF01_AE毒株的致病機(jī)制至關(guān)重要。
　　目的：構(gòu)建CRF01_AE毒株的感染性克隆，為深入研究其致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：采用半巢式PCR方法分兩段擴(kuò)增CRF01_

9、AE毒株全長基因組，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后分別連接T載體構(gòu)建半分子克?。焕肁arI和XholI限制性內(nèi)切酶酶切兩個半分子克隆，將兩個半分子片段進(jìn)行連接，構(gòu)建全長克??；將獲得的全長克隆轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，包裝CRF01_AE感染性克隆的衍生病毒。將包裝的病毒感染MT2細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變，測定獲得的細(xì)胞培養(yǎng)上清的p24和TCID50；以p24的量為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制衍生病毒在MT2上的復(fù)制動力學(xué)曲線，比較其與野生型病毒的復(fù)制能力差異

10、；利用表達(dá)不同受體的U87細(xì)胞測定衍生病毒的嗜性。
　　結(jié)果：經(jīng)過PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化成功構(gòu)建CRF01_AE全長克隆，獲得長度13630bp的全長克隆質(zhì)粒，其中病毒序列長為9702bp，具有15個獨(dú)立的開放閱讀框。將全長克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)上清的p24為0.375ug/ml；轉(zhuǎn)染獲得的衍生病毒再次感染MT2細(xì)胞，觀察到明顯的細(xì)胞病變，其培養(yǎng)上清的p24為19.1ug/ml，TCID50為15588；衍生病毒的復(fù)