阿霉素誘導(dǎo)人下咽癌(FaDu)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　下咽癌(Hypopharyngeal carcinoma)是頭頸惡性腫瘤中預(yù)后最差的一種，其具有的惡性腫瘤的生物學(xué)行為及特征:侵犯性、擴(kuò)散性及轉(zhuǎn)移性均很高，早期即容易出現(xiàn)粘膜下播散和淋巴轉(zhuǎn)移。目前國內(nèi)外較為確切的有效的治療方法是以根治性手術(shù)為主，輔以局部放射和全身應(yīng)用化學(xué)藥物的綜合療法。綜合治療下咽癌的方法及技術(shù)在不斷改進(jìn)，但下咽癌患者總體的5年生存率并沒有得到明顯改善.近年來，藥物在頭頸腫瘤腫瘤的治療中的作用逐漸受到

2、重視，目前認(rèn)為對于晚期以及復(fù)發(fā)、或轉(zhuǎn)移的下咽癌患者化療和或靶向藥物治療是主要手段?；瘜W(xué)藥物能降低頭頸鱗癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，減少腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、提高患者生存率。研究下咽鱗狀細(xì)胞癌在化學(xué)藥物作用下的分子機(jī)制，希望產(chǎn)生新的治療下咽癌的有效方法。
　　在化學(xué)藥物的作用下腫瘤會出現(xiàn)死亡，一方面是藥物對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，使腫瘤細(xì)胞的被動(dòng)死亡即壞死，另一方面更在于其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡.惡性腫瘤的基本特征之一是:凋亡受阻，并對凋亡誘導(dǎo)因子的敏感性降

3、低，使機(jī)體不能清除腫瘤細(xì)胞。近年來，越來越多的研究表明:化療藥物對細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡是其主要作用機(jī)制?；熕幬锟梢哉T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而達(dá)到抑制腫瘤的作用。目前發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)能夠介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這是一種新的細(xì)胞凋亡途徑，關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在細(xì)胞凋亡中的重要作用，越來越得到廣泛的重視。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中最普遍和重要細(xì)胞器，是蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、糖類的合成場所，蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成、折疊

4、、組裝、運(yùn)輸。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)源或外源的因素會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂，未折疊蛋白和錯(cuò)誤蛋白積累過量，激活一系列信號通路，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)細(xì)胞存活和凋亡程序同時(shí)激活，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)進(jìn)行就會啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激決定了細(xì)胞的生存還是死亡。在腫瘤細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激一方面直接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡另一方面也使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。
　　阿霉素(Doxorubicin)是一種廣泛應(yīng)用于臨床的有效抗腫瘤藥物。它通過插入DNA堿

5、基對使DNA降解，影響DNA轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)腫瘤的治療作用。阿霉素是對腫瘤細(xì)胞的周期性非特異性藥物，對各種生長階段腫瘤細(xì)胞的都有殺死作用。其抗腫瘤譜超過任何其他類型的化療藥物。但阿霉素因其本身的細(xì)胞毒性的副作用，同時(shí)也限制了它的臨床應(yīng)用。其抗腫瘤譜超過任何其他類型的化療藥物。但阿霉素因其本身的細(xì)胞毒性的副作用，同時(shí)也限制了它的臨床應(yīng)用。
　　大量文獻(xiàn)報(bào)道阿霉素可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，但對人下咽鱗狀細(xì)胞癌的凋亡作用還未見報(bào)道，其誘導(dǎo)凋亡的

6、詳細(xì)作用機(jī)制尚未明了。阿霉素是否可以通過介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)FaDu的細(xì)胞凋亡？因此建立阿霉素誘導(dǎo)下咽癌細(xì)胞系細(xì)胞(FaDu)凋亡的實(shí)驗(yàn)體系模型，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺中研究下咽癌細(xì)胞系(FaDu)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡過程中的分子機(jī)制，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在藥物作用下對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，希望從腫瘤發(fā)生凋亡的分子生物學(xué)的基礎(chǔ)上尋找內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞死亡的藥物作用靶點(diǎn)，以期將來在化療藥物研制上，能設(shè)計(jì)和開發(fā)針對ERS信號通路的有效藥物來遏制下咽癌，這是本實(shí)驗(yàn)

7、所具有的積極意義。
　　方法：
　　以人下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(FaDu)為實(shí)驗(yàn)材料，
　　1.FaDu細(xì)胞培養(yǎng)。然后用SRB比色法，在阿霉素濃度和處理時(shí)間不同的情況下，檢測FaDu細(xì)胞的存活率。
　　2.應(yīng)用梯度為0μM，0.5μM，1μM，2μM的阿霉素作用于FaDu細(xì)胞，Westernblot檢測FaDu細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化。
　　3.在有效藥物濃度1μM阿霉素作用不同時(shí)間后，We

8、stern blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化。
　　4.0.5μM的阿霉素(DOX)和0.5μM的毒胡蘿卜素(TG)聯(lián)合用藥，SRB法檢測細(xì)胞存活率;Western blot檢測FaDu細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化。
　　5.0.5μM的阿霉素(DOX)和1mM4-PBA(4-苯基丁酸)聯(lián)合用藥，SRB法檢測細(xì)胞存活率;Western blot檢測FaDu細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋

9、白的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.結(jié)果顯示，阿霉素(Doxorubicin)可以顯著降低FaDu細(xì)胞相對存活率，其效應(yīng)具有顯著的時(shí)間和劑量依賴性。
　　2.應(yīng)用doxorubicin的時(shí)間梯度和濃度梯度，隨著濃度增加和處理時(shí)間的增加，Western blot檢測結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白CASP8，CASP3，PARP-1切割增強(qiáng)，TNFRSF10B表達(dá)水平上升，CFLARL表達(dá)下降;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白EIF2AK3，

10、ATF4，DDIT3表達(dá)水平下降，ERN1，XBP1s表達(dá)水平上升。
　　3.敲低EIF2AK3，Western blot檢測結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白CASP8，CASP3，PARP-1切割增強(qiáng)，TNFRSF10B表達(dá)水平上升，CFLARL表達(dá)下降。
　　4.Doxorubicin聯(lián)合TG,Western blot檢測結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白CASP8，CASP3，PARP-1切割減弱，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白ERN1，XBP1s表達(dá)水平

11、明顯上升。
　　5.Doxorubicin聯(lián)合4-PBA，Western blot檢測結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白CASP8，CASP3，PARP-1切割增強(qiáng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白EIF2AK3，ATF4，DDIT3表達(dá)水平下降明顯。
　　結(jié)論：
　　1.Doxorubicin能顯著抑制FaDu細(xì)胞增殖、引起FaDu細(xì)胞凋亡。
　　2.Doxorubicin能使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白ERN1，XBP1s表達(dá)升高。
　　3.D