黑線倉鼠及其白化突變系(A-CHA)皮膚差異表達(dá)基因的篩選和驗(yàn)證.pdf

1、黑線倉鼠白化突變系（A：CHA）是徐植嵐等人在黑線倉鼠種群內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種自發(fā)突變的眼皮膚型白化動(dòng)物。A：CHA品系在體表寄生蟲，皮膚微循環(huán)、輻射防護(hù)、以及流行病學(xué)等各方面的應(yīng)用，都表現(xiàn)出了比黑線倉鼠具有更多的優(yōu)越性。A：CHA品系的培育在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域提供了新的動(dòng)物模型，同時(shí)也為我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物領(lǐng)域增添了一個(gè)新型的動(dòng)物模型品系。
　　為了進(jìn)一步分析A：CHA品系白化性狀產(chǎn)生的原因，完善品系的遺傳背景資料，本課題對黑線倉鼠及其A：CHA進(jìn)行

2、轉(zhuǎn)錄組測序。首先利用A：CHA品系與黑線倉鼠進(jìn)行回交后產(chǎn)生F1代小鼠，然后將F1代小鼠進(jìn)行交配，產(chǎn)生性狀分離的F2代。其中白色的F2代為純合子，而黑色的F2代可能為純合子也可能是雜合子。將黑色的F2代與白色的純合子交配，未產(chǎn)生性狀分離的為純合子。由此產(chǎn)生的黑色和白色純合子，遺傳背景基本一致，在進(jìn)行RNA-seq分析時(shí)，非特異性的差別就會(huì)較少。選擇2只黑線倉鼠和白化突變系純合子個(gè)體，4只個(gè)體分別命名為白1、白2、黑1、黑2，利用TRIZO

3、L法提取2只黑線倉鼠、2只白化突變系純合子個(gè)體的皮膚總RNA，經(jīng)質(zhì)量檢測合格后，交由華大基因進(jìn)行RNA-seq測序和分析。
　　對RNA-seq測序所得基因進(jìn)行分析，獲得二者差異表達(dá)的基因，并利用熒光定量和Western-blot進(jìn)行驗(yàn)證，所得結(jié)果如下：
　　1.通過對黑線倉鼠及其白化突變系進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測序，共得到42，665，789條reads，拼接過濾后得到了有注釋的顯著差異基因（FDR≤0.001且log2Ratio≥

4、1）有3675個(gè)，其中上調(diào)基因有1691個(gè)，下調(diào)基因有1984個(gè)。黑1：白1，黑2：白1，黑1：白2，黑2：白2全部下調(diào)大于2倍的基因有92個(gè)，全部上調(diào)大于2倍的基因69個(gè)。黑色素合成通路中酶的變化不明顯，可能細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的運(yùn)輸存在障礙，這與前期研究中病理學(xué)觀察到的結(jié)果相符。按照蛋白質(zhì)的功能劃分，泛素化蛋白(363個(gè))占總差異蛋白的9.87％，超過了皮膚中總量最多的角質(zhì)蛋白，推測黑色素的運(yùn)輸障礙可能與蛋白的泛素化存在一定的關(guān)聯(lián)性。

5、r>　　2.Gene Ontology功能顯著性富集結(jié)果：細(xì)胞的組成顯著差異的基因包括中間纖維、中間絲細(xì)胞骨架等。分子功能顯著差異蛋白基因包括細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白、受體結(jié)合蛋白、酶調(diào)節(jié)活性蛋白、結(jié)合蛋白以及?；o酶A脫氫酶活性蛋白基因等。生物學(xué)進(jìn)程顯著差異的基因包括發(fā)育過程、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育、系統(tǒng)發(fā)育、器官發(fā)育和細(xì)胞分化相關(guān)基因等。
　　3.KEGG Pathway顯著性富集結(jié)果：黑線倉鼠和A：CHA存在顯著差別的信號通路主要包括PPAR

6、信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路、肥厚性心肌病信號通路、血管平滑肌收縮信號通路、致心律失常性右室心肌病信號通路和甘油酯的代謝信號通路等。
　　4.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法驗(yàn)證了高通量測序得到的15個(gè)基因，結(jié)果表明這15個(gè)基因在黑線倉鼠及其白化突變系的表達(dá)差異性與測序結(jié)果基本一致，從而表明測序數(shù)據(jù)具有較高的可信度。
　　5.利用Western-blot對高通量測序的結(jié)果中的4種差異蛋白進(jìn)行了分析，Western-blot結(jié)果與高通