先天性小耳畸形相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選與驗(yàn)證研究.pdf

1、目的:
　　通過對(duì)先天性小耳畸形殘耳軟骨組織及對(duì)側(cè)正常耳軟骨組織的芯片檢測(cè)，篩選小耳畸形相關(guān)差異表達(dá)基因，通過生物信息學(xué)分析選擇部分與小耳畸形關(guān)系較密切的基因，通過qRT-PCR和Western blotting方法進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)變化，為深入研究先天性小耳畸形的分子機(jī)制及其防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　標(biāo)本源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院收治的單側(cè)先天性小耳畸形患者。患耳均無感染及軟骨炎等征象。每例標(biāo)本均于手術(shù)過

2、程中取殘耳軟骨組織（術(shù)中剔除的部分，約100mg）和正常側(cè)（耳顱角較大側(cè)）耳軟骨組織（術(shù)中廢棄的部分，約100mg），其中以殘耳軟骨組織為實(shí)驗(yàn)組，正常側(cè)耳軟骨組織為對(duì)照組。取材后立即將軟骨組織于液氮中保存或直接提取總RNA和總蛋白。
　　通過美國(guó)Agilent公司的Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0篩選單側(cè)先天性小耳畸形患者殘耳軟骨組織（實(shí)驗(yàn)組）和正常側(cè)耳軟骨組織（對(duì)照組）的差異表達(dá)基因，

3、根據(jù)生物信息學(xué)分析選擇與小耳畸形更為相關(guān)的ZNF44、Wdr82和FGFR2基因，通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chainreaction，qRT-PCR)和Western blotting方法進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組軟骨組織RNA質(zhì)檢結(jié)果顯示:OD260/280值分別1.95、1.86、1.85、1.87、1.88和1.88，

4、28S和18S條帶清晰，無基因組DNA污染。提取的RNA具有良好的完整性和純度。
　　2.從雜交圖上可見密集的cy3綠色熒光呈規(guī)則的圓形，雜交點(diǎn)間沒有重疊現(xiàn)象，信號(hào)明顯，圖像背景低，無灰塵噪聲信號(hào)。
　　3.芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示:先天性小耳畸形軟骨組織中差異表達(dá)基因共553條，其中表達(dá)下調(diào)的基因433條，如鋅指蛋白44(zinc finger protein44，ZNF44)基因和WD40重復(fù)蛋白82（WD40 repeat

5、 protein82，Wdr82）基因分別下調(diào)2.00倍和3.65倍，表達(dá)上調(diào)的基因120條，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（fibro-blast growth factor2，F(xiàn)GF-2）基因上調(diào)2.64倍。這些差異表達(dá)基因涉及胚胎發(fā)育、肢體形成、骨骼發(fā)育及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)事件。
　　4.qRT-PCR方法驗(yàn)證差異表達(dá)基因mRNA水平的表達(dá)，結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組軟骨組織中ZNF44（t=5.398，P＜0.01）和Wdr82

6、（t=5.519，P＜0.01）基因表達(dá)下調(diào)，而FGFR2(t=4.588， P＜0.01)基因表達(dá)上調(diào)。與芯片結(jié)果一致。
　　5.Western blotting法驗(yàn)證差異表達(dá)基因蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組軟骨組織中ZNF44（t=4.396，P＜0.05）和Wdr82（t=6.910，P＜0.01）基因表達(dá)下調(diào)，而FGFR2(t=13.187，P＜0.01)基因表達(dá)上調(diào)。與芯片結(jié)果和qRT-PCR結(jié)果一致。