胃癌與腹膜轉移中差異表達micRNA的篩選及目的基因的功能驗證.pdf

1、研究背景:惡性腫瘤是近年來嚴重威脅人類健康與生命的主要疾病，是世界范圍內較為棘手的問題，人人談癌色變。胃癌的患病率更是位居各種惡性腫瘤之二，僅次于肺癌，每年死于胃癌的人數(shù)多達近60萬，主要是因為其發(fā)病率很高但早期診治率卻很低。大約2/3的病人在發(fā)現(xiàn)或者明確診斷之前已經(jīng)發(fā)生了遠處轉移，這樣就造成了手術機會的喪失和病人生活質量的下降，中晚期發(fā)生轉移的患者5年生存率低于15％，其中發(fā)生腹膜轉移是胃癌患者死亡的主要原因之一。
　　胃癌腹膜

2、轉移過程由一系列先后發(fā)生的獨立事件所組成，是多種分子在多種作用途徑上，經(jīng)過多步驟所起到的不同作用，隨著科學技術的進步與發(fā)展，胃癌腹膜轉移基因的調控在胃癌及腹膜轉移的發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用被研究人員逐步認識?；蚣夹g的蓬勃發(fā)展為闡明各種腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制帶來了希望。然而，對單個基因的研究并不能闡明胃癌腹膜轉移的通路，并且不能找到分子間相互作用的方式。找到胃癌腹膜轉移過程中有差異表達的基因，驗證它們在胃癌腹膜轉移發(fā)生過程中的作用，進而

3、研究獲得大量分子間的相互作用可能在胃癌腹膜轉移或者所有惡性腫瘤發(fā)生機制上都會有所幫助，高通量篩選方法為多方面理解腹膜轉移的機制帶來了新的機會，目前研究腫瘤轉移的高通量篩選方法從策略上來說基本分為基因差異表達與表型依賴的篩選，基因差異的篩選最經(jīng)典的是基因芯片技術，應用此方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多在腫瘤原發(fā)灶和轉移灶中表達差異的基因，這些基因如何調控轉移過程還需要進一步深入研究。近年來microRNA與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，轉移，侵襲等調控機制關系非常

4、密切，目前將腫瘤轉移的高通量篩選等技術綜合運用到腹膜轉移機制的研究尤為重要。
　　目的:1.篩選出胃癌細胞GC9811和腹膜高轉移細胞系 GC9811-P中有差異表達的miRNA并分析驗證差異倍數(shù)，篩選出可能與腹膜轉移有關系的基因作為研究的目的分子；
　　2.研究目的分子miRNA-21-5p和miRNA-146-5p的功能，探索其在胃癌及腹膜轉移過程中的作用。
　　方法:1.細胞培養(yǎng)、總RNA提?。喝⊥粫r間復蘇，相

5、同條件下培養(yǎng)的細胞GC9811和GC9811-P對數(shù)生長48后提取總RNA,檢測總RNA的OD值在1.8-2.0之間時用干冰冷凍送公司做細胞GC9811和GC9811-P的miRNA微陣列篩選差異表達的miRNA；用SPSS軟件分析做出miRNA差異表達圖譜；
　　2. RT-PCR的方法驗證目的基因在細胞GC9811和GC9811-P中的表達差異情況，并用2-ΔΔCt法計算相對值，選 U6作為內參對照；
　　3.病毒包裝與

6、轉染:做陰性對照病毒及目的基因下調的病毒包裝，選取親本細胞系GC9811做病毒轉染干擾目的基因的表達；
　　4.用RT-PCR及免疫熒光檢測的方法驗證陰性對照及目的分子miRNA-21-5p和miRNA-146-5p的下調病毒轉染細胞GC9811的效率和轉染后兩種目的分子的表達情況；
　　5.遷移實驗和侵襲實驗驗證目的基因對胃癌細胞GC9811轉移能力的影響；
　　6.用生物信息學的方法檢測目的基因作用的靶基因。

7、>　　結果:1.通過miRNA微陣列技術的篩選，統(tǒng)計檢驗和聚類分析：GC9811和GC9811-P之間存在差異的miRNA共有153個，其中在GC9811-P中表達下調的有79個，表達上調的有74個，其中信號強度大于500且P值小于0.01的共有8個，P值小于0.05的有42個，P值小于0.10的共有19個；
　　2.利用RT-PCR的實驗方進一步驗證了信號強度大于500，P值小于0.01的8個分子，其差異表達與miRNA微陣列服

8、務技術的篩選結果一致；
　　3.將陰性對照病毒、miRNA-21-5p下調病毒和miRNA-146a-5P下調病毒轉染進細胞GC9811中，分別標記為GC9811-NC, GC9811-21-IH和GC9811-146a-IH，用免疫熒光的方式檢測三種病毒轉染成功；
　　4. RT-PCR實驗證明GC9811-21-IH和GC9811-NC相比其miRNA-21-5p的表達確實下降, GC9811-146a-IH和GC981

9、1-NC相比其miRNA-146a-5p也表達下調；
　　5.體外侵襲及轉移實驗證明目的分子miRNA-21-5p和miRNA-146a-5p下調表達基因和陰性對照基因轉染進入胃癌細胞GC9811中后，轉染目的基因病毒的GC9811-21-IH,GC9811-146a-IH細胞比轉染陰性對照病毒的GC9811-NC細胞轉移數(shù)多。
　　1.胃癌細胞GC9811和腹膜高轉移細胞系GC9811-P之間存在差異的miRNA共有153