胃癌與腹膜轉(zhuǎn)移中差異表達(dá)micRNA的篩選及目的基因的功能驗(yàn)證.pdf

1、研究背景:惡性腫瘤是近年來(lái)嚴(yán)重威脅人類健康與生命的主要疾病，是世界范圍內(nèi)較為棘手的問(wèn)題，人人談癌色變。胃癌的患病率更是位居各種惡性腫瘤之二，僅次于肺癌，每年死于胃癌的人數(shù)多達(dá)近60萬(wàn)，主要是因?yàn)槠浒l(fā)病率很高但早期診治率卻很低。大約2/3的病人在發(fā)現(xiàn)或者明確診斷之前已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這樣就造成了手術(shù)機(jī)會(huì)的喪失和病人生活質(zhì)量的下降，中晚期發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者5年生存率低于15％，其中發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因之一。
　　胃癌腹膜

2、轉(zhuǎn)移過(guò)程由一系列先后發(fā)生的獨(dú)立事件所組成，是多種分子在多種作用途徑上，經(jīng)過(guò)多步驟所起到的不同作用，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，胃癌腹膜轉(zhuǎn)移基因的調(diào)控在胃癌及腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用被研究人員逐步認(rèn)識(shí)。基因技術(shù)的蓬勃發(fā)展為闡明各種腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制帶來(lái)了希望。然而，對(duì)單個(gè)基因的研究并不能闡明胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的通路，并且不能找到分子間相互作用的方式。找到胃癌腹膜轉(zhuǎn)移過(guò)程中有差異表達(dá)的基因，驗(yàn)證它們?cè)谖赴└鼓まD(zhuǎn)移發(fā)生過(guò)程中的作用，進(jìn)而

3、研究獲得大量分子間的相互作用可能在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移或者所有惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制上都會(huì)有所幫助，高通量篩選方法為多方面理解腹膜轉(zhuǎn)移的機(jī)制帶來(lái)了新的機(jī)會(huì)，目前研究腫瘤轉(zhuǎn)移的高通量篩選方法從策略上來(lái)說(shuō)基本分為基因差異表達(dá)與表型依賴的篩選，基因差異的篩選最經(jīng)典的是基因芯片技術(shù)，應(yīng)用此方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多在腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)差異的基因，這些基因如何調(diào)控轉(zhuǎn)移過(guò)程還需要進(jìn)一步深入研究。近年來(lái)microRNA與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，轉(zhuǎn)移，侵襲等調(diào)控機(jī)制關(guān)系非常

4、密切，目前將腫瘤轉(zhuǎn)移的高通量篩選等技術(shù)綜合運(yùn)用到腹膜轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究尤為重要。
　　目的:1.篩選出胃癌細(xì)胞GC9811和腹膜高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系 GC9811-P中有差異表達(dá)的miRNA并分析驗(yàn)證差異倍數(shù)，篩選出可能與腹膜轉(zhuǎn)移有關(guān)系的基因作為研究的目的分子；
　　2.研究目的分子miRNA-21-5p和miRNA-146-5p的功能，探索其在胃癌及腹膜轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。
　　方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)、總RNA提?。喝⊥粫r(shí)間復(fù)蘇，相

5、同條件下培養(yǎng)的細(xì)胞GC9811和GC9811-P對(duì)數(shù)生長(zhǎng)48后提取總RNA,檢測(cè)總RNA的OD值在1.8-2.0之間時(shí)用干冰冷凍送公司做細(xì)胞GC9811和GC9811-P的miRNA微陣列篩選差異表達(dá)的miRNA；用SPSS軟件分析做出miRNA差異表達(dá)圖譜；
　　2. RT-PCR的方法驗(yàn)證目的基因在細(xì)胞GC9811和GC9811-P中的表達(dá)差異情況，并用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)值，選 U6作為內(nèi)參對(duì)照；
　　3.病毒包裝與

6、轉(zhuǎn)染:做陰性對(duì)照病毒及目的基因下調(diào)的病毒包裝，選取親本細(xì)胞系GC9811做病毒轉(zhuǎn)染干擾目的基因的表達(dá)；
　　4.用RT-PCR及免疫熒光檢測(cè)的方法驗(yàn)證陰性對(duì)照及目的分子miRNA-21-5p和miRNA-146-5p的下調(diào)病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞GC9811的效率和轉(zhuǎn)染后兩種目的分子的表達(dá)情況；
　　5.遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證目的基因?qū)ξ赴┘?xì)胞GC9811轉(zhuǎn)移能力的影響；
　　6.用生物信息學(xué)的方法檢測(cè)目的基因作用的靶基因。

7、>　　結(jié)果:1.通過(guò)miRNA微陣列技術(shù)的篩選，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)和聚類分析：GC9811和GC9811-P之間存在差異的miRNA共有153個(gè)，其中在GC9811-P中表達(dá)下調(diào)的有79個(gè)，表達(dá)上調(diào)的有74個(gè)，其中信號(hào)強(qiáng)度大于500且P值小于0.01的共有8個(gè)，P值小于0.05的有42個(gè)，P值小于0.10的共有19個(gè)；
　　2.利用RT-PCR的實(shí)驗(yàn)方進(jìn)一步驗(yàn)證了信號(hào)強(qiáng)度大于500，P值小于0.01的8個(gè)分子，其差異表達(dá)與miRNA微陣列服

8、務(wù)技術(shù)的篩選結(jié)果一致；
　　3.將陰性對(duì)照病毒、miRNA-21-5p下調(diào)病毒和miRNA-146a-5P下調(diào)病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞GC9811中，分別標(biāo)記為GC9811-NC, GC9811-21-IH和GC9811-146a-IH，用免疫熒光的方式檢測(cè)三種病毒轉(zhuǎn)染成功；
　　4. RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明GC9811-21-IH和GC9811-NC相比其miRNA-21-5p的表達(dá)確實(shí)下降, GC9811-146a-IH和GC981

9、1-NC相比其miRNA-146a-5p也表達(dá)下調(diào)；
　　5.體外侵襲及轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證明目的分子miRNA-21-5p和miRNA-146a-5p下調(diào)表達(dá)基因和陰性對(duì)照基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入胃癌細(xì)胞GC9811中后，轉(zhuǎn)染目的基因病毒的GC9811-21-IH,GC9811-146a-IH細(xì)胞比轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照病毒的GC9811-NC細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)多。
　　1.胃癌細(xì)胞GC9811和腹膜高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系GC9811-P之間存在差異的miRNA共有153