轉(zhuǎn)染BMP-2基因的脂肪干細(xì)胞移植對(duì)大鼠肺動(dòng)脈高壓的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓(pulmonary Arterial Hypertension，PAH)是以肺動(dòng)脈壓力增高為特征的一類疾病，其發(fā)病機(jī)制至今仍不明了。已知血管重構(gòu)是肺動(dòng)脈高壓的重要病理特征，其主要病理改變是血管平滑肌層增厚造成管腔狹窄、閉塞。肺血管重構(gòu)可引起肺動(dòng)脈壓力升高，肺血管阻力增大而加重右心室后負(fù)荷，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致右室肥厚、心力衰竭甚至死亡。延緩肺血管重構(gòu)，改善心肺功能是藥物治療肺動(dòng)脈高壓，提高患者生存率的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
　　骨形成蛋白(

2、Bone morphogenetic proteins，BMPs)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming Growth Factor，TGF)超家族成員之一。BMP可結(jié)合位于細(xì)胞膜上的絲氨酸/絡(luò)氨酸受體復(fù)合物（由BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ組成，進(jìn)而磷酸化激活胞內(nèi)Smad信號(hào)分子，SmadS入核啟動(dòng)下游基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，骨形成蛋白Ⅱ型受體(BMPR-Ⅱ)突變是導(dǎo)致遺傳性肺動(dòng)脈高壓的主要發(fā)病因素，也發(fā)現(xiàn)于25％左右的特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者

3、。在低氧誘導(dǎo)和野百合堿注射誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型也發(fā)現(xiàn)BMPR-Ⅱ表達(dá)下調(diào)，BMP信號(hào)通路功能受損。因此，BMP信號(hào)通路被認(rèn)為是PAH發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)通路，其中的BMP-2信號(hào)通路可恢復(fù)細(xì)胞凋亡和增殖的平衡狀態(tài)，顯著改善肺血管重構(gòu)，在細(xì)胞凋亡、增殖和轉(zhuǎn)化中擔(dān)當(dāng)著重要的調(diào)控作用。研究表明，BMP-2信號(hào)是維持內(nèi)皮細(xì)胞正常功能的重要因素。
　　脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose Derived Stromal Cells，

4、ADSCs)是一種來(lái)源于脂肪可以向中胚層多種細(xì)胞誘導(dǎo)分化的多能干細(xì)胞，因其取材簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷小，少量脂肪組織即可獲取大量細(xì)胞，體外培養(yǎng)方便，擴(kuò)增容易而倍受研究者的關(guān)注，而且體外研究指出ADSCs可以分泌大量的促血管新生的細(xì)胞因子如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular EndothelialGrowth Factor，VEGF)等。將ADSCS用于缺血性疾病取得了滿意的

5、結(jié)果，更有研究將該種細(xì)胞用于肺損傷模型，如肺氣腫的動(dòng)物模型，依靠ADSCs的多向分化功能和/或其分泌作用增加肺組織的血管及腺泡的生成和修復(fù)，從而改善了肺組織的血流灌注和換氣功能。
　　本研究以此為切入點(diǎn)，將ADSCs與BMP-2相結(jié)合，通過(guò)對(duì)大鼠野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓治療及機(jī)制的探討，以證實(shí)轉(zhuǎn)染BMP-2基因ADSCs細(xì)胞移植在減少肺血管重構(gòu)、減輕炎癥反應(yīng)、修復(fù)肺組織損傷方面所起的作用。
　　材料和方法：
　　雄性成

6、年SD大鼠購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，8-10周齡，體重220-250g，10％水合氯醛0.3ml/100g腹腔麻醉。
　　實(shí)驗(yàn)一:于嚴(yán)格無(wú)菌條件下取大鼠腹股溝脂肪組織，剪碎后用膠原酶消化，反復(fù)過(guò)濾離心獲取ADSCS，體外培養(yǎng)觀察細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行表型和功能鑒定。將構(gòu)建的慢病毒eGFP-BMP-2基因載體轉(zhuǎn)染ADSCs，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，檢測(cè)細(xì)胞的BMP-2蛋白分泌和表達(dá)情況，檢測(cè)細(xì)胞的遷移、增殖能力。
　　實(shí)驗(yàn)二:

7、雄性Sprague-Dawley大鼠32只，隨機(jī)均分為四組，每組8只:正常對(duì)照組（C組）、肺動(dòng)脈高壓組（MCT組）、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療組(ADSCs)、轉(zhuǎn)染BMP2基因組（BMP2組）。MCT組、ADSCs和BMP2組組一次性腹腔注射MCT60mg/Kg，C組經(jīng)腹腔注射相同體積的生理鹽水，兩周后ADMSC組經(jīng)右頸外靜脈一次性給予ADMSC5×106/1ml，C組和PAH組經(jīng)左頸外靜脈一次性給予1ml的生理鹽水。于ADMSC移植后2W，

8、右心導(dǎo)管法測(cè)定大鼠的肺動(dòng)脈平均壓(MPAP)、右心室肥厚指數(shù)[RVHI％=右心室游離壁(RV)重量/左心室+室間隔(LV+S)重量]、并運(yùn)用ipp6.0圖像分析軟件分析肺組織切片，測(cè)定直徑在100-200μm范圍的肺小動(dòng)脈管壁厚度(WT)占動(dòng)脈外徑(ED)的百分比(WT％)及管壁面積(WA)占血管總面積的百分比(WA％)。熒光顯微鏡觀察帶GFP標(biāo)記的ADMSC在肺內(nèi)的定植。Western blot和Real time-PCR檢測(cè)肺組織B

9、MP-2、BMPR2、Smad1、survivin和P21的mRNA與蛋白表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同組間參數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一:大鼠腹股溝脂肪組織經(jīng)過(guò)膠原酶消化后，72小時(shí)細(xì)胞貼壁，成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，原代細(xì)胞分離種植后7-10天融合至90％左右可以傳代，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，約2-3天即可再次傳

10、代。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面免疫表型，CD29，CD90，CD105陽(yáng)性，CD14，CD45基本陰性。油紅染色鑒定成脂誘導(dǎo)14天后的細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞漿內(nèi)脂滴染成紅色，茜素紅染色鑒定成骨誘導(dǎo)14天的ADSCS，細(xì)胞變長(zhǎng)，聚集，細(xì)胞漿可見(jiàn)棕紅色的鈣化沉積顆粒。慢病毒eGFP-BMP-2基因轉(zhuǎn)染ADSCs后，倒置相差熒光顯微鏡下可見(jiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，轉(zhuǎn)BMP-2基因EPC的BMP-2蛋白分泌和表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞MTT及tr

11、answell活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞與空載及未轉(zhuǎn)染組生長(zhǎng)曲線及遷移能力，沒(méi)有明顯差異(P＞0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)二:轉(zhuǎn)BMP-2基因EPC移植后可定位于肺組織。與MCT組相比，ADSCs組和轉(zhuǎn)基因ADSCs組可明顯改善肺組織的病理學(xué)改變，治療組大鼠的MPAP、RVHI％、WA％和WT％明顯降低，轉(zhuǎn)基因ADSCs組降低更為明顯，轉(zhuǎn)基因ADSCs組的肺組織可檢測(cè)到BMP-2和BMPR2蛋白和mRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，Smad

12、1 mRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，并且轉(zhuǎn)基因ADSCs組與單純ADSCs組比較可檢測(cè)到更多的P21蛋白表達(dá)，及更少的survivin蛋白表達(dá)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、慢病毒eGFP-BMP-2基因轉(zhuǎn)染ADSCs后，可增加ADSCs分泌和表達(dá)BMP-2蛋白，對(duì)其增殖活性和遷移能力無(wú)明顯影響。
　　2、轉(zhuǎn)BMP-2基因ADSCs移植后可定位于肺損傷部位，使肺組織的BMP-2蛋白和mRNA表達(dá)增加，進(jìn)而