髓核樣細(xì)胞與溫敏型支架復(fù)合培養(yǎng)的探索研究.pdf

1、椎間盤(IntervertebralDisc,IVD)由軟骨終板、髓核以及纖維環(huán)組成，髓核（Nucleuspulposus）是椎間盤結(jié)構(gòu)與功能的核心，包含髓核細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)。人類椎間盤在生命中“第二個十年”就開始退變，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、基質(zhì)成分改變、纖維環(huán)松弛等病理變化。而椎間盤退變是一系列脊柱退行性疾病發(fā)生的前提和始動環(huán)節(jié)，特別是下腰痛發(fā)生的首要因素。如若可以控制椎間盤退變進(jìn)程，就可以從一方面防止這些疾病的發(fā)生。組織工程技術(shù)是利用種子細(xì)

2、胞結(jié)合載體、支架材料重建組織器官、修復(fù)病變的方法，這一技術(shù)的成功應(yīng)用，可以從根本上解決椎間盤退變的問題。目前多選用間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，在體外以適宜的方法誘導(dǎo)其分化為髓核樣細(xì)胞。復(fù)合生長因子誘導(dǎo)以及細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)在業(yè)界均有一定研究，但二者對于脂肪干細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞分化的效果有何不同，尚需探索。另外，本實驗把處于軟骨組織工程領(lǐng)域內(nèi)研究熱點的殼聚糖基可注射支架與誘導(dǎo)后的髓核樣細(xì)胞復(fù)合，評估其是否具備良好的相容性并維持髓核樣細(xì)胞的分化表型

3、、保證正常的細(xì)胞外基質(zhì)分泌，為“可注射支架復(fù)合髓核樣細(xì)胞微創(chuàng)修復(fù)退變椎間盤”這一臨床應(yīng)用構(gòu)想進(jìn)行體外實驗。
　　實驗一選取2月齡新西蘭兔，從肩胛間脂肪組織提取脂肪干細(xì)胞并提取髓核細(xì)胞，分別進(jìn)行體外單層培養(yǎng)擴增，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；脂肪干細(xì)胞傳3代后，流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原；將3代脂肪干細(xì)胞分為兩組，一組以成髓核誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化2周，另一組與髓核細(xì)胞在Transwell培養(yǎng)板中共培養(yǎng)2周，比較兩組細(xì)胞在蛋白聚糖、Ⅱ型膠原m

4、RNA表達(dá)水平上的差異。
　　實驗二以兔脂肪干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，采用實驗一中成髓核誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)為髓核樣細(xì)胞；以氯化殼聚糖（C）與β-甘油磷酸鈉（GP）構(gòu)建溫敏型可注射支架。將細(xì)胞與支架混合，37℃成膠后，在成髓核誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，通過AO-PI染色法和掃描電鏡觀測細(xì)胞存活情況，PR-PCR檢測蛋白聚糖、Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果證明，生長因子誘導(dǎo)與共培養(yǎng)誘導(dǎo)對細(xì)胞在蛋白聚糖、Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)水平上均無統(tǒng)計