核酸信標配基的構(gòu)建、合成、活性鑒定及檢測技術(shù)的研究.pdf

1、隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展，對分子檢測技術(shù)的特異性、靈敏度有著更高要求。尤其是在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究中，分子的定性和定量檢測具有非常重要的意義。因此，探索新技術(shù)或改進現(xiàn)有技術(shù)以提高分子水平的精確定量，突破檢測技術(shù)這一瓶頸，是目前科研工作的重中之重。
　　 本研究目的是構(gòu)建一個具有配體識別和信號擴增能力的檢測分子。在核酸信標配基的研究中，利用指數(shù)級富集配基進化技術(shù)（SELEX）篩選到小鼠IgG 抗體 Fc片段的特異性寡核苷酸配基，并進行了克隆

2、、測序、序列分析及采用多種方法進行特異性鑒定，如：利用PCR進行陽性克隆篩選，dot-blot 陽性配基篩選，高壓液相色譜，凝膠阻滯等活性鑒定。共篩選到16株特異性配基克隆。同時，首次建立了一套較為完整的SELEX 硝酸纖維素濾膜快速篩選方法。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明了核酸信標配基，完成設(shè)計、合成及活性鑒定。核酸信標配基是通過巢式-PCR 方法，在配基的5 ’端連接一段熒光標記探針的靶（Beacon）序列，該序列是由兩端兩個引物和中間Taqma

3、n 探針的互補序列構(gòu)成，和靶分子具有對應(yīng)性，即雙鏈核酸信息標記的核酸信標配基。由于核酸信標是雙鏈，不影響配基和靶分子（Fc片段）的結(jié)合，因此通過核酸信標來完成信息傳導(dǎo)和信號放大功能。本文首次利用瓊脂糖凝膠阻滯放射自顯影和考馬斯亮蘭雙顯色方法，對核酸信標配基和抗體結(jié)合特異性進行鑒定。另外，本文首次建立兩種方法對核酸信標配基進行功能鑒定：一種方法是核酸信標配基免疫－PCR 方法（NBA-iPCR），該方法是通過核酸信標配基與抗體結(jié)合形成信標

4、配基-抗體復(fù)合物作為檢測分子，再利用配基-抗體與抗原結(jié)合形成信標配基-抗體-抗原復(fù)合物，完成抗原信號到核酸信號的傳遞。通過實時定量－PCR 檢測證明，核酸信標配基具有傳感和擴增能力。另一種方法是核酸信標配基－PCR 方法（NBA-PCR），該方法是將核酸信標配基作為檢測分子，通過核酸信標配基和靶分子（抗體）結(jié)合形成配基-靶分子復(fù)合物，完成靶分子信號到核酸信號的傳遞。通過實時定量－PCR 檢測證明，核酸信標配基自身具有配基和配體識別能力和