核酸信標(biāo)配基的構(gòu)建、合成、活性鑒定及檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展，對(duì)分子檢測(cè)技術(shù)的特異性、靈敏度有著更高要求。尤其是在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究中，分子的定性和定量檢測(cè)具有非常重要的意義。因此，探索新技術(shù)或改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)以提高分子水平的精確定量，突破檢測(cè)技術(shù)這一瓶頸，是目前科研工作的重中之重。
　　 本研究目的是構(gòu)建一個(gè)具有配體識(shí)別和信號(hào)擴(kuò)增能力的檢測(cè)分子。在核酸信標(biāo)配基的研究中，利用指數(shù)級(jí)富集配基進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選到小鼠IgG 抗體 Fc片段的特異性寡核苷酸配基，并進(jìn)行了克隆

2、、測(cè)序、序列分析及采用多種方法進(jìn)行特異性鑒定，如：利用PCR進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，dot-blot 陽(yáng)性配基篩選，高壓液相色譜，凝膠阻滯等活性鑒定。共篩選到16株特異性配基克隆。同時(shí)，首次建立了一套較為完整的SELEX 硝酸纖維素濾膜快速篩選方法。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明了核酸信標(biāo)配基，完成設(shè)計(jì)、合成及活性鑒定。核酸信標(biāo)配基是通過(guò)巢式-PCR 方法，在配基的5 ’端連接一段熒光標(biāo)記探針的靶（Beacon）序列，該序列是由兩端兩個(gè)引物和中間Taqma

3、n 探針的互補(bǔ)序列構(gòu)成，和靶分子具有對(duì)應(yīng)性，即雙鏈核酸信息標(biāo)記的核酸信標(biāo)配基。由于核酸信標(biāo)是雙鏈，不影響配基和靶分子（Fc片段）的結(jié)合，因此通過(guò)核酸信標(biāo)來(lái)完成信息傳導(dǎo)和信號(hào)放大功能。本文首次利用瓊脂糖凝膠阻滯放射自顯影和考馬斯亮蘭雙顯色方法，對(duì)核酸信標(biāo)配基和抗體結(jié)合特異性進(jìn)行鑒定。另外，本文首次建立兩種方法對(duì)核酸信標(biāo)配基進(jìn)行功能鑒定：一種方法是核酸信標(biāo)配基免疫－PCR 方法（NBA-iPCR），該方法是通過(guò)核酸信標(biāo)配基與抗體結(jié)合形成信標(biāo)

4、配基-抗體復(fù)合物作為檢測(cè)分子，再利用配基-抗體與抗原結(jié)合形成信標(biāo)配基-抗體-抗原復(fù)合物，完成抗原信號(hào)到核酸信號(hào)的傳遞。通過(guò)實(shí)時(shí)定量－PCR 檢測(cè)證明，核酸信標(biāo)配基具有傳感和擴(kuò)增能力。另一種方法是核酸信標(biāo)配基－PCR 方法（NBA-PCR），該方法是將核酸信標(biāo)配基作為檢測(cè)分子，通過(guò)核酸信標(biāo)配基和靶分子（抗體）結(jié)合形成配基-靶分子復(fù)合物，完成靶分子信號(hào)到核酸信號(hào)的傳遞。通過(guò)實(shí)時(shí)定量－PCR 檢測(cè)證明，核酸信標(biāo)配基自身具有配基和配體識(shí)別能力和