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1、滾環(huán)放大(rolling circle amplificatio,RCA)是新近發(fā)展起來的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法。該技術(shù)是借鑒噬菌體DNA分子滾環(huán)式的復(fù)制方式建立起的核酸擴(kuò)增技術(shù)。這種方法可以直接擴(kuò)增DNA,實(shí)現(xiàn)對靶核酸的信號放大,取得核酸分析的高靈敏度,因此在核酸檢測中具有很大的應(yīng)用價值和潛力。
在本文中,我們利用鎖式探針在連接反應(yīng)中的單堿基識別的特異性和滾環(huán)放大技術(shù)對目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測,同時研究了由于單堿基突變所形成的單
2、核苷酸多態(tài)性。鎖式探針是一段線性DNA,它可以與另一段具有特殊序列的DNA發(fā)生識別作用,彎曲成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。只有能夠發(fā)生連接反應(yīng)的鎖式探針才可發(fā)生滾環(huán)放大反應(yīng)。放大后,延伸產(chǎn)物與標(biāo)記在金納米粒子上的DNA進(jìn)行雜交,通過檢測其共振光散射(resonancelight—scattering,RLS)強(qiáng)度來檢測目標(biāo)DNA的含量。該方法在放大反應(yīng)后不需分離,得到的共振光散射強(qiáng)度與目標(biāo)DNA濃度在0.1 nmol/L~2.0 nmol/L范圍內(nèi)呈良好
3、線性關(guān)系,檢出限為0.077 nmol/L。
在RCA反應(yīng)過程中會產(chǎn)生大量的堿基延伸,當(dāng)dNTPs結(jié)合到模板的同時釋放出等量的焦磷酸(PPi),而焦磷酸可以降解為磷酸,所以可以通過檢測溶液中磷酸的含量間接檢測DNA。本文第三部分中,我們建立了一種測定微量磷酸的共振光散射分析新方法。研究發(fā)現(xiàn)在H2SO4介質(zhì)中,PO43—與MoO42—反應(yīng)生成磷鉬雜多酸,磷鉬雜多酸與陽離子染料奎寧可形成穩(wěn)定的離子締合物,并在398.0 nm處
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