四個(gè)miniSTR基因座熒光復(fù)合分型體系的構(gòu)建及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、目的:miniSTR技術(shù)即在設(shè)計(jì)引物時(shí),使其結(jié)合在更靠近核心重復(fù)序列的區(qū)域,PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物就會(huì)比STR基因座更短一些,可提高高度降解檢材的檢測(cè)成功率。大量研究證實(shí),miniSTR檢測(cè)技術(shù)對(duì)于高度降解檢材是很有效的一種手段。2006年美國AB公司研制開發(fā)了minifiler試劑盒,目前已被應(yīng)用到實(shí)際案件的分析中。但minifiler試劑盒僅包含8個(gè)CODIS系統(tǒng)(DNA聯(lián)合索引系統(tǒng))內(nèi)的STR基因座,其系統(tǒng)效能不足以進(jìn)行個(gè)人識(shí)別及親緣關(guān)

2、系鑒定。因此,為了研究更多的miniSTR基因座,并為研制國產(chǎn)化試劑盒做準(zhǔn)備,本實(shí)驗(yàn)室自2005年以來研究了Hill等[1]報(bào)道的26個(gè)非CODIS系統(tǒng)miniSTR基因座在中國漢族人群的群體遺傳學(xué)特征,并從中篩選出12個(gè)多態(tài)性較好的基因座用于研發(fā)復(fù)合分型試劑盒,目前已經(jīng)成功構(gòu)建了兩組共包括8個(gè)miniSTR基因座的復(fù)合分型體系。本研究在我實(shí)驗(yàn)室既往成果的基礎(chǔ)上繼續(xù)構(gòu)建第三組miniSTR復(fù)合分型系統(tǒng),包括D6S474、D20S482、

3、D4S2408和D6S1017四個(gè)miniSTR基因座,用分子克隆的技術(shù)制備其等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物,調(diào)查四個(gè)基因座在中國漢族及回族人群中的遺傳多態(tài)性,并探討其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法:采用Chelex-100法提取135份中國漢族和114份中國回族無關(guān)健康個(gè)體全血基因組DNA。利用熒光復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增D6S474、D20S482、D4S2408和D6S1017四個(gè)miniSTR基因座,ABI310/3130基因分析儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行

4、檢測(cè),Genemapper3.2軟件分析結(jié)果。根據(jù)電泳結(jié)果對(duì)反應(yīng)體系中的引物濃度、Mg2+濃度、DNA模板量、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化,以獲得最佳反應(yīng)條件。用構(gòu)建的復(fù)合體系對(duì)所有樣本的四個(gè)miniSTR基因座進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增。
　　 根據(jù)所有樣本的群體遺傳學(xué)研究結(jié)果,應(yīng)用分子克隆技術(shù)制備四個(gè)基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物,并按照國際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)(internationalsociety of forensic geneti

5、cs,ISFG)推薦的命名原則對(duì)各等位基因進(jìn)行命名。根據(jù)構(gòu)建的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物及測(cè)序結(jié)果對(duì)所有樣本復(fù)合擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等位基因命名,計(jì)算各基因座等位基因頻率及法醫(yī)學(xué)參數(shù)。
　　 對(duì)構(gòu)建的熒光標(biāo)記miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系進(jìn)行靈敏度、腐敗降解檢材DNA檢測(cè)能力的研究,并與商品化STR試劑盒進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:本研究成功建立了熒光標(biāo)記miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系,并用分子克隆技術(shù)制備了miniSTR基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物

6、。利用該分型體系進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn):D6S474、D20S482、D4S2408和D6S1017基因座在135份中國漢族無關(guān)個(gè)體中分別檢出7、8、6、6個(gè)等位基因和14、18、14、14種基因型;在114份中國回族無關(guān)個(gè)體中分別檢出6、7、5、7個(gè)等位基因和15、23、13、17種基因型?；蛐皖l率分布經(jīng)x2檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。四個(gè)基因座在中國漢族人群的雜合度觀察值(Ho)依次為0.748、0

7、.711、0.748、0.659;在中國回族人群依次為0.759、0.706、0.714、0.804。在中國漢族人群的多態(tài)信息含量(PIC)依次為0.68、0.66、0.67、0.64;在中國回族人群依次為0.70、0.73、0.69、0.68。在中國漢族人群的非父排除率(PE)依次為0.507、0.446、0.507、0.368;在中國回族人群依次為0.525、0.438、0.451、0.606。在中國漢族人群的個(gè)人識(shí)別力(DP)依次

8、為0.874、0.871、0.862、0.851;在中國回族人群依次為0.884、0.911、0.880、0.860。四個(gè)miniSTR基因座的累積非父排除率在中國漢族人群為0.914902,在中國回族人群為0.942257;累積個(gè)人識(shí)別力在中國漢族人群為0.999666,在中國回族人群為0.999827。系統(tǒng)靈敏度研究:本研究構(gòu)建的miniSTR復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)對(duì)0.0625ng的DNA仍可進(jìn)行四個(gè)基因座的正確分型。腐敗降解檢材研究:結(jié)果

9、顯示對(duì)降解五個(gè)月的血液檢材DNA和用Dnase I消化25min的DNA,應(yīng)用miniSTR復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)分析在四個(gè)基因座中均得到了完整分型,顯示了miniSTR技術(shù)比常規(guī)STR試劑盒對(duì)降解檢材具有更高的分型成功率。
　　 結(jié)論:本研究成功建立了四個(gè)miniSTR基因座D6S474、D20S482、D4S2408和D6S1017的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系并應(yīng)用分子克隆技術(shù)制備了四個(gè)基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。將自制的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物