D3S3053，D6S474，D20S482，D1GATA113，D2S1776，D4S2408 miniSTR基因座四色熒光分型體系的構(gòu)建及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、目的：自上世紀(jì)80年代以來(lái)，短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandem repeats，STR)遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，由于在人類基因組中分布廣泛，高度的遺傳多態(tài)性以及簡(jiǎn)單快捷的檢測(cè)方法而成為法庭科學(xué)鑒定中最常用、發(fā)展最成熟的技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，STR數(shù)據(jù)成為各國(guó)法庭科學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的主要構(gòu)成。目前法醫(yī)學(xué)主要運(yùn)用常染色體STR基因座和線粒體DNA遺傳標(biāo)記，能夠解決大部分個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定案例。然而，在許多法醫(yī)案例中，DNA樣本由于各種原因而被高

2、度降解或被混入環(huán)境污染物，在使用商品化STR復(fù)合擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，片段較長(zhǎng)的STR基因座往往無(wú)法進(jìn)行有效的擴(kuò)增，片段檢測(cè)不到信號(hào)，而這個(gè)問(wèn)題隨著PCR反應(yīng)產(chǎn)生大量的PCR產(chǎn)物而被擴(kuò)大。miniSTR基因座分析技術(shù)在設(shè)計(jì)引物時(shí)，使其盡可能靠近核心重復(fù)序列而縮短擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，用于高度降解的DNA樣本檢測(cè)可提高檢測(cè)成功率。miniSTR基因座被歐洲D(zhuǎn)NA分型工作組(the european DNA profiling group，EDNA

3、P)定義為繼STR之后的新一代遺傳標(biāo)記。美國(guó)、日本、西班牙、新加坡、韓國(guó)等國(guó)家也相繼報(bào)道了miniSTR基因座的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值，而我國(guó)相關(guān)報(bào)道較少并缺乏群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。本研究選取D3S3053，D6S474，D20S482，D1GATA113，D2S1776，D4S2408等六個(gè)miniSTR基因座，調(diào)查其在中國(guó)漢族人群中的遺傳多態(tài)性，并探討其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。方法：采用天根血液基因組DNA提取試劑盒提取120份河北漢族

4、無(wú)關(guān)健康個(gè)體全血基因組DNA。將D20S482、D2S1776兩個(gè)基因座的上游引物5’端用6-FAM熒光標(biāo)記，D3S3053、D1GATA113兩個(gè)基因座的上游引物5’端用HEX熒光標(biāo)記，D6S474、D4S2408兩個(gè)基因座的上游引物5’端用TAMRA熒光標(biāo)記，對(duì)所有樣本的六個(gè)miniSTR基因座進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增，其中D3S3053、D6S474、D20S482三個(gè)基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，D1GATA113、D2S1776、D4S240

5、8三個(gè)基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體系為10μl，分別加入各個(gè)基因座特異性的引物，并設(shè)定適宜的退火溫度，經(jīng)28個(gè)循環(huán)后，可得到各個(gè)基因座長(zhǎng)度不等的等位基因片段。PCR復(fù)合擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI PRISM 310基因分析儀上自動(dòng)完成進(jìn)樣電泳和電泳結(jié)果數(shù)據(jù)收集，結(jié)果用Genemapper 3.2計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物片段相對(duì)大小并進(jìn)行樣本基因型分型。計(jì)算各基因座基因頻率及各法醫(yī)學(xué)參數(shù)。選取本法醫(yī)鑒定中心既往親子鑒定的家系樣本9例，對(duì)6個(gè)miniSTR

6、基因座進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的研究。提取同一尸體的心臟、肝臟、脾臟、肺組織、腎臟、腦組織、肌肉組織、皮膚及尸體血痕檢材進(jìn)行組織同一性分析。將9947A DNA樣本稀釋成1ng、0.5ng、0.1ng、0.05：ng進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。此外，將新鮮血液放置于夏季的自然環(huán)境中一周、兩周、四周和八周模擬降解檢材，應(yīng)用本研究構(gòu)建的6個(gè)miniSTR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增分型體系及商品化常規(guī)STR試劑盒進(jìn)行DNA分型，比較二者分型的成功率。 結(jié)果：本

7、研究建立了兩組熒光復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)6個(gè)miniSTR基因座基因型的方法。復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)樣本的分型結(jié)果顯示，六個(gè)miniSTR基因座等位基因都獲得了清晰的基因型分型結(jié)果，無(wú)干擾分型的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)6個(gè)基因座都可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確分型。相關(guān)遺傳學(xué)參數(shù)：六個(gè)基因座的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均小于150bp。120名河北漢族無(wú)關(guān)個(gè)體中D3S3053、D6S474、D20S482、D1GATA113、D2S1776、D4S2408基因座分別檢出6、6、7、8、8、7個(gè)

8、等位基因和14、16、15、27、27、23種基因型，基因型頻率分布經(jīng)x2檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。六個(gè)基因座在中國(guó)漢族人群的雜合度觀察值(Ho)分別為0.652，0.758，0.758，0.667，0.617，0.85：多態(tài)性信息含量(PIC)分別依次為0.64，0.68，0.69，0.83，0.85，0.83；非父排除率(PE)分別依次為0.298，0.523，0.523，0.313，0.271，0

9、.662；個(gè)人識(shí)別力(PD)分別依次為0.862，0.857，0.877，0.943，0.947，0.917。六個(gè)miniSTR基因座的累積非父排除概率為0.97，累積個(gè)人識(shí)別力為0.9999994。遺傳穩(wěn)定性分析：對(duì)9個(gè)已經(jīng)確定親權(quán)關(guān)系的家系樣本研究表明，父母的等位基因能夠穩(wěn)定地遺傳給子女，符合孟德爾遺傳定律。組織同一性分析：對(duì)來(lái)自同一尸體不同組織的檢測(cè)表明，六個(gè)基因座在同一個(gè)體中具有同一性，符合STR基因座用做法醫(yī)DNA分析的標(biāo)準(zhǔn)。

10、系統(tǒng)靈敏度研究：在DNA含量為0.1ng時(shí)，Identifile試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量比較低，不易進(jìn)行正確的分型，而應(yīng)用miniSTR復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)對(duì)0.05ng的DNA還可以進(jìn)行分型。降解微量檢材研究：對(duì)降解兩個(gè)月的檢材，雖然擴(kuò)增的特異度有所下降，但對(duì)分型結(jié)果沒有干擾，在六個(gè)miniSTR基因座中均得到了完整分型，顯示了miniSTR技術(shù)比常規(guī)SFR試劑盒具有更高的分型成功率。 結(jié)論：D3S3053、D6S474、D20S482、D