金魚生長激素Ⅰ和人角質(zhì)細(xì)胞生長因子異源表達(dá)的研究.pdf

1、本文主要從以下兩分部分展開： (1)魚生長激素(Fish growth hormone，fGH)是魚類腦垂體中分泌的促進(jìn)生長的單一亞基的蛋白激素。它參與魚的生長代謝，能夠加速蛋白質(zhì)合成和脂類降解等生理功能，具有增強(qiáng)食欲、提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用。天然魚GH含量極低，分離純化成本較高?；蚬こ碳夹g(shù)為生產(chǎn)大量低成本的魚生長激素創(chuàng)造了條件，且很多實驗證明重組魚GH具有天然魚GH的功能，卻不會對人體產(chǎn)生激素副作用。因此，生產(chǎn)基因重組魚GH

2、在養(yǎng)殖領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。 用引入酶切位點BamHⅠ和NotⅠ的引物，以質(zhì)粒pBluescript SK-gfGHⅠ為模板，PCR擴(kuò)增獲得了gfGHⅠ編碼區(qū)序列，分別定向插入原核表達(dá)載體pET-28a和pGEX-4T-2中，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-gfGHⅠ和pGEX-4T-2-gfGHⅠ，pET28a-gfGHⅠ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在1.0 mM IPTG誘導(dǎo)下，表達(dá)出融合蛋白(His)6 tag-g

3、fGHⅠ，該蛋白分子量大約為26KD；經(jīng)質(zhì)譜以及抗HIS抗體的Western blotting鑒定，該融合蛋白即為表達(dá)的目的蛋白；經(jīng)超聲鑒定該蛋白為包涵體形式存在，嘗試用連續(xù)超聲破碎的方法，回收該蛋白純度可達(dá)85.1％，免疫小鼠，間接ELISA法檢測抗體效價為1：1600。 pGEX-4T-2-gfGHⅠ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)1.0m M IPTG誘導(dǎo)可表達(dá)分子量約46 KD的特異蛋白GSTtag-gfGHⅠ

4、。在28-37℃溫度條件下分別產(chǎn)生以可溶性的和包涵體形式為主的特異蛋白，經(jīng)28℃誘導(dǎo)的菌體裂解液上清經(jīng)GST Resin純化獲得GSTtag-gfGHⅠ。純化的GSTtag-gfGHⅠ腹腔注射錦鯉(Cryprinus carpiod)，經(jīng)4周處理后，實驗組的體重增長率比對照組高24.68％，體長增長率比對照組高11.82％。經(jīng)t檢驗統(tǒng)計分析表明，表達(dá)的重組gfGHⅠ具有顯著的促錦鯉生長作用(P＜0.05)。 利用植物作為生物反

5、應(yīng)器生產(chǎn)具有醫(yī)用價值的蛋白或者抗體是植物基因工程的一個研究熱點。同大腸桿菌等微生物相比，植物作為生物反應(yīng)器具有翻譯后正確的修飾、加工，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點，構(gòu)建了植物表達(dá)載體p1301-35S-gfGHⅠ-Tnos，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化了水稻愈傷組織。對得到的再生水稻通過組織化學(xué)染色、PCR檢測，確認(rèn)外源基因已經(jīng)成功插入水稻基因組中。進(jìn)一步通過RT-PCR對轉(zhuǎn)基因株系分析，證明gfGHⅠ基因可以轉(zhuǎn)錄。對轉(zhuǎn)基因植株子代進(jìn)行PCR和RT—PCR

6、檢測，發(fā)現(xiàn)gfGHⅠ基因能成功的遺傳給子代且在子代中同樣能夠轉(zhuǎn)錄成功。 (2)角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)是成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)家族的成員，即FGF—7，最初從人胚胎肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)上清中分離純化獲得。KGF在表皮細(xì)胞的生長和更新過程中起著重要作用，能加快膀胱、腎和腸的損傷修復(fù)和促人角膜上皮細(xì)胞生長。畢赤酵母具有分子遺傳操作簡單、外源蛋白高水平表達(dá)、具有近似于哺乳動物細(xì)胞翻譯后的修飾與加工功能和安全性好等特點。

7、 用EcoRⅠ和NotⅠ酶切質(zhì)粒PMD18—T—KGF，膠回收后定向插入pPIC9K質(zhì)粒，構(gòu)建酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K—KGF。pPIC9K—KGF質(zhì)粒用Bpu1102Ⅰ酶切線性處理化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母，用G418—MD平板法、菌落PCR和總DNA PCR法篩選重組子，以及MM/MD篩選法鑒定重組菌株表型為His+Mut+，用RT—PCR分析表明，KGF在酵母中成功轉(zhuǎn)錄，用SDS—PAGE分析表明，重組KGF蛋白可在畢赤酵母中獲得表達(dá)，