絞股藍懸浮細胞系的建立及超聲輻照誘變效應(yīng)研究.pdf

1、絞股藍(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino)為葫蘆科 Cucurbitaceae絞股藍屬Gynostemma多年生草質(zhì)藤本植物，是一種著名的中藥。它在我國分布廣泛，野生資源豐富。我國各地如廣東、福建、陜西、浙江、湖北、江西、安徽、四川、山東、河北等省已引種栽培成功。 超聲輻照屬于物理誘變源，與其他誘變源相比，具有方便廉價，綠色安全等優(yōu)點。它對植物的生長發(fā)育有重要的影響。超聲輻照對染色體的致

2、畸作用，可以被利用，來進行遺傳、育種方面的研究。目前，對超聲輻照誘變效應(yīng)的研究比較多，但其系統(tǒng)性、綜合性研究還不夠深入。因而，超聲輻照誘變與分子生物學(xué)技術(shù)、生物工程等其他育種途徑相互結(jié)合，進一步加強機理和效應(yīng)等方面的研究，提高誘變效率是非常必要的。 本試驗選取絞股藍作為材料，進行了懸浮細胞培養(yǎng)研究。并應(yīng)用懸浮細胞系作為誘變材料，引入了超聲輻照對目標(biāo)植物進行誘變處理，綜合細胞工程與超聲輻照誘變方便快捷等特點，研究不同時間的超聲輻照

3、對絞股藍的影響，嘗試從形態(tài)特征、細胞和分子水平上揭示超聲輻照對絞股藍種子及懸浮細胞系的損傷效應(yīng)。主要的研究結(jié)果如下： 1.絞股藍種子萌發(fā)對溫度的適宜性較強，從4℃到35℃均可以發(fā)芽，在60℃和80℃的高溫處理中，有個別種子仍然能夠保持生活力。對不同級別種子發(fā)芽率的試驗說明，大田收獲的絞股藍種子飽滿度不一，通過種子精選，可以增加種子萌發(fā)率，提高其使用價值。同時超聲處理絞股藍種子相對于6-BA、GA<,3>和2，4-D等3種處理方法

4、而言，可以有效提高發(fā)芽率，而且只有高劑量的超聲處理才會對絞股藍幼苗產(chǎn)生影響。處理后的植株沒有發(fā)生形態(tài)學(xué)方面的變異，對各個時期的生長進程也未見明顯變化。因此，可采用10min超聲處理，作為大規(guī)模播種的前處理，應(yīng)用于大田生產(chǎn)的前處理。 2.篩選出了適宜進行懸浮培養(yǎng)，質(zhì)地疏松且生長旺盛的淡黃色愈傷組織，確定最佳懸浮培養(yǎng)基配比為：MS+2.4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L。置于25℃散射光或黑暗條件，100--120r/mi

5、n旋轉(zhuǎn)式搖床上震蕩培養(yǎng)，兩周后，在無菌條件下先用80目篩網(wǎng)濾去較大顆粒，再用100目濾取較小細胞團。繼代培養(yǎng)獲得絞股藍細胞懸浮液。 3.使用不同的超聲時間梯度處理絞股藍根尖細胞，觀察染色體的變化。發(fā)現(xiàn)超聲輻照能夠引起絞股藍染色體畸變。產(chǎn)生的類型主要包括：微核、染色體斷片、染色體橋、落后染色體等。這種影響隨著超聲時間的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)超聲時間超過30min，染色體畸變情況明顯加劇，在一個細胞里可能出現(xiàn)多種畸變類型。

6、4．使用不同的超聲時間梯度處理絞股藍懸浮細胞，懸浮細胞系生長進程變緩，需要經(jīng)過一個相對較長的適應(yīng)期之后才能進入到細胞的對數(shù)生長期。同時，細胞生長隨著超聲輻照時間的不同呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，而長時間的超聲輻照處理則會造成細胞膜受損破裂，胞內(nèi)物質(zhì)外溢，導(dǎo)致細胞死亡。 5．經(jīng)過超聲輻照的愈傷組織都多少能夠分化，說明絞股藍對超聲輻照是有一定程度的耐受性。而超聲輻照后的愈傷組織分化率則受到了不同程度的影響，這種影響和超聲輻照的時間呈正相關(guān)。短

7、時間的超聲輻照對愈傷組織的分化和再生植株的形態(tài)影響不大。而從8min超聲輻照開始，再生率明顯下降，部分愈傷組織出現(xiàn)褐化。同時使用超聲輻照和細胞懸浮培養(yǎng)及組織培養(yǎng)的方式，可以切實產(chǎn)生畸變，經(jīng)過超聲輻照過后的再生植株產(chǎn)生了一系列的變化，表現(xiàn)為分枝增多、葉片畸形、葉片變小、節(jié)間變短等。 6．我們利用RAPD(Random Amplified Polymorphic DNAs)方法，探討了超聲輻照對絞股藍再生植株DNA多態(tài)性的影響，電泳