劍尾魚腦細(xì)胞系和胚胎細(xì)胞系的建立及苯并(a)芘對其脅迫效應(yīng)的研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(即PAHs)是指含有兩個苯環(huán)以上的一系列芳烴及其衍生物，來源于有機物熱解或不完全燃燒，生態(tài)系統(tǒng)中具有較強的持久性、生物活性、生物累積性和緩慢生物降解性，研究表明，由于其是誘導(dǎo)機體突變的物質(zhì)和致癌物質(zhì)的前體[2]，在環(huán)境中具有潛在的致癌、致畸和致突變性，可通過食物鏈危害人類健康。給人類健康和生態(tài)環(huán)境帶來一定的潛在風(fēng)險。CYP1A1、CYP3A、GST和P-gp是生物體細(xì)胞內(nèi)參與PAHs環(huán)境污染物代謝的基因，當(dāng)生物體受到環(huán)境中PA

2、Hs暴露脅迫時，會直接影響CYP1A1、CYP3A、GST和P-gpmRNA的表達，CYP1A1、CYP3A、GST和P-gp在基因水平上的變化可作為良好生物標(biāo)志物對生物體所處的污染狀態(tài)和潛在危險進行預(yù)警，并達到監(jiān)測PAHs環(huán)境污染物的目的。本研究選取PAHs中典型代表污染物苯并(a)芘，以劍尾魚為實驗材料進行體內(nèi)實驗，以劍尾魚原代肝組織、劍尾魚腦細(xì)胞系和胚胎細(xì)胞系作為實驗材料進行體外暴露實驗，通過體內(nèi)和體外實驗，對B(a)P分子水平生

3、物標(biāo)志物的研究，探討其對水環(huán)境存在的潛在危害，為其使用的生態(tài)風(fēng)險評估提供實驗依據(jù)。
　　 主要研究包括：
　　 (1)利用SYBRGreenⅡ熒光定量PCR技術(shù)，建立了劍尾魚CYP1A1基因mRNA水平的定量分析方法。建立了劍尾魚CYP1A1基因表達的檢測方法和定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，構(gòu)建的劍尾魚CYP1A1和β-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)品Ct值檢測范圍分別為10-26，12-26，擴增效率分別為100.53％，98.40％；建立的標(biāo)

4、準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上；融解曲線分析結(jié)果顯示具有特異的單個峰，表明擴增產(chǎn)物特異性非常好。本實驗建立了CYP1A1基因的實時熒光定量PCR方法，能滿足檢測微量樣品中劍尾CYP1A1基因表達的要求。
　　 (2)以劍尾魚為試驗動物，研究苯并(a)芘在不同劑量及作用時間下對CYP1A1和P-gp基因表達的影響。體內(nèi)暴露實驗，研究CYP1A1基因在劍尾魚各組織的表達情況，同時研究B(a)P對CYP1A1和

5、P-gp基因表達的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系：體外暴露實驗，B(a)P暴露劍尾魚原代肝細(xì)胞，采用實時定量RT-PCR方法對劍尾魚CYP1A1基因的表達進行了檢測。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，CYP1A1和P-gp基因在腦、脾、肝臟、腎、腸中均有表達，B(a)P對CYP1A1基因有誘導(dǎo)作用，對P-gp表達有抑制效應(yīng)；在本實驗設(shè)計濃度下，體內(nèi)實驗，CYP1A1基因的表達與B(a)P的暴露濃度均呈現(xiàn)很好的劑量一效應(yīng)關(guān)系，在暴露7dCYP1A1基因表達量達到

6、最高，P-gp的表達量隨誘導(dǎo)濃度的升高而降低，暴露3dP-gp的基因表達量最高；體外暴露肝組織塊實驗，CYP1A1基因的表達與B(a)P的暴露濃度均呈現(xiàn)很好的劑量一效應(yīng)關(guān)系，在暴露48hCYP1A1基因表達量達到最高，P-gp的表達量總體上隨誘導(dǎo)濃度和時間的規(guī)律性不強，進一步在細(xì)胞水平上進行暴露實驗很有必要。
　　 (3)建立了劍尾魚腦細(xì)胞系和胚胎細(xì)胞系，本文采用胰蛋白酶消化法進行劍尾魚腦組織和胚胎組織的體外培養(yǎng)，并通過對培養(yǎng)液

7、配方條件的優(yōu)化成功地進行了劍尾魚腦細(xì)胞和胚胎的原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)。結(jié)果顯示，兩種的最適培養(yǎng)液為含有15％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12+L-15培養(yǎng)液，添加堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)及胰島素樣生長因子，最適培養(yǎng)條件為27℃，5％CO2。細(xì)胞的貼壁、生長和分裂狀態(tài)良好，腦細(xì)胞為典型的神經(jīng)樣細(xì)胞形態(tài)，胚胎細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞形態(tài)；經(jīng)連續(xù)繼代培養(yǎng)后，已成功建立了劍尾魚腦細(xì)胞系和胚胎細(xì)胞系，現(xiàn)已繼代培養(yǎng)腦細(xì)胞至

8、第95代，胚胎細(xì)胞至85代；兩株細(xì)胞系細(xì)胞經(jīng)液氮凍存復(fù)蘇后仍保持其原有細(xì)胞形態(tài)，其貼壁生長狀態(tài)和增殖速度也與凍存前無差異；生長特性鑒定結(jié)果顯示，第65代劍尾魚腦細(xì)胞系細(xì)胞的群體倍增時間為43.048h，60代胚胎細(xì)胞的群體倍增時間為38.49h，表明細(xì)胞的生長分裂依然十分旺盛。染色體分析結(jié)果顯示，劍尾魚腦細(xì)胞和胚胎細(xì)胞特征性染色體數(shù)目為48條，表明所建立的細(xì)胞系確為劍尾魚腦細(xì)胞系和胚胎細(xì)胞系。
　　 (4)以劍尾魚腦細(xì)胞和胚胎細(xì)

9、胞為試驗材料，通過SYBRGreenⅡ?qū)崟r熒光定量PCR方法檢測苯并(a)芘在不同劑量及作用時間下劍尾魚腦細(xì)胞和胚胎細(xì)胞GST、CYP1A1、CYP3A和P-gpmRNA的相對表達量，來研究苯并(a)芘對劍尾魚腦細(xì)胞和胚胎細(xì)胞的毒性效應(yīng)。結(jié)果顯示：在腦細(xì)胞中，B(a)P對CYP1A1mRNA的相對表達量極顯著性誘導(dǎo)，存在很好的劑量一效應(yīng)關(guān)系，而在時間上呈現(xiàn)抑制的效應(yīng)；在本實驗設(shè)計濃度下，P-gpmRNA、GSTmRNA的相對表達量變化趨

10、勢與CYP3AmRNA一致，相對表達量隨著B(a)P濃度的增加而不斷下降，呈現(xiàn)出抑制的效應(yīng)關(guān)系，而在時間上的效應(yīng)關(guān)系無明顯的規(guī)律。胚胎細(xì)胞中，苯并(a)芘對胚胎細(xì)胞CYP1A1也是呈現(xiàn)強誘導(dǎo)效應(yīng)，存在劑量一效應(yīng)關(guān)系；在時間上，低濃度呈現(xiàn)抑制效應(yīng)，高濃度組，呈現(xiàn)波動式的先抑制后誘導(dǎo)再強抑制的效應(yīng)關(guān)系。B(a)P在時間和濃度上對P-gpmRNA、CYP3AmRNA的表達量均呈現(xiàn)抑制的效應(yīng)，對GSTmRNA的表達量影響規(guī)律不明顯。劍尾魚腦細(xì)胞