劍尾魚腦細胞系和胚胎細胞系的建立及苯并(a)芘對其脅迫效應的研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(即PAHs)是指含有兩個苯環(huán)以上的一系列芳烴及其衍生物，來源于有機物熱解或不完全燃燒，生態(tài)系統(tǒng)中具有較強的持久性、生物活性、生物累積性和緩慢生物降解性，研究表明，由于其是誘導機體突變的物質和致癌物質的前體[2]，在環(huán)境中具有潛在的致癌、致畸和致突變性，可通過食物鏈危害人類健康。給人類健康和生態(tài)環(huán)境帶來一定的潛在風險。CYP1A1、CYP3A、GST和P-gp是生物體細胞內參與PAHs環(huán)境污染物代謝的基因，當生物體受到環(huán)境中PA

2、Hs暴露脅迫時，會直接影響CYP1A1、CYP3A、GST和P-gpmRNA的表達，CYP1A1、CYP3A、GST和P-gp在基因水平上的變化可作為良好生物標志物對生物體所處的污染狀態(tài)和潛在危險進行預警，并達到監(jiān)測PAHs環(huán)境污染物的目的。本研究選取PAHs中典型代表污染物苯并(a)芘，以劍尾魚為實驗材料進行體內實驗，以劍尾魚原代肝組織、劍尾魚腦細胞系和胚胎細胞系作為實驗材料進行體外暴露實驗，通過體內和體外實驗，對B(a)P分子水平生

3、物標志物的研究，探討其對水環(huán)境存在的潛在危害，為其使用的生態(tài)風險評估提供實驗依據。
　　 主要研究包括：
　　 (1)利用SYBRGreenⅡ熒光定量PCR技術，建立了劍尾魚CYP1A1基因mRNA水平的定量分析方法。建立了劍尾魚CYP1A1基因表達的檢測方法和定量標準曲線，構建的劍尾魚CYP1A1和β-actin基因的標準品Ct值檢測范圍分別為10-26，12-26，擴增效率分別為100.53％，98.40％；建立的標

4、準曲線具有良好的線性關系，相關系數R2均在0.99以上；融解曲線分析結果顯示具有特異的單個峰，表明擴增產物特異性非常好。本實驗建立了CYP1A1基因的實時熒光定量PCR方法，能滿足檢測微量樣品中劍尾CYP1A1基因表達的要求。
　　 (2)以劍尾魚為試驗動物，研究苯并(a)芘在不同劑量及作用時間下對CYP1A1和P-gp基因表達的影響。體內暴露實驗，研究CYP1A1基因在劍尾魚各組織的表達情況，同時研究B(a)P對CYP1A1和

5、P-gp基因表達的劑量效應和時間效應關系：體外暴露實驗，B(a)P暴露劍尾魚原代肝細胞，采用實時定量RT-PCR方法對劍尾魚CYP1A1基因的表達進行了檢測。體內實驗結果表明，CYP1A1和P-gp基因在腦、脾、肝臟、腎、腸中均有表達，B(a)P對CYP1A1基因有誘導作用，對P-gp表達有抑制效應；在本實驗設計濃度下，體內實驗，CYP1A1基因的表達與B(a)P的暴露濃度均呈現很好的劑量一效應關系，在暴露7dCYP1A1基因表達量達到

6、最高，P-gp的表達量隨誘導濃度的升高而降低，暴露3dP-gp的基因表達量最高；體外暴露肝組織塊實驗，CYP1A1基因的表達與B(a)P的暴露濃度均呈現很好的劑量一效應關系，在暴露48hCYP1A1基因表達量達到最高，P-gp的表達量總體上隨誘導濃度和時間的規(guī)律性不強，進一步在細胞水平上進行暴露實驗很有必要。
　　 (3)建立了劍尾魚腦細胞系和胚胎細胞系，本文采用胰蛋白酶消化法進行劍尾魚腦組織和胚胎組織的體外培養(yǎng)，并通過對培養(yǎng)液

7、配方條件的優(yōu)化成功地進行了劍尾魚腦細胞和胚胎的原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)。結果顯示，兩種的最適培養(yǎng)液為含有15％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12+L-15培養(yǎng)液，添加堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)及胰島素樣生長因子，最適培養(yǎng)條件為27℃，5％CO2。細胞的貼壁、生長和分裂狀態(tài)良好，腦細胞為典型的神經樣細胞形態(tài)，胚胎細胞為上皮樣細胞形態(tài)；經連續(xù)繼代培養(yǎng)后，已成功建立了劍尾魚腦細胞系和胚胎細胞系，現已繼代培養(yǎng)腦細胞至

8、第95代，胚胎細胞至85代；兩株細胞系細胞經液氮凍存復蘇后仍保持其原有細胞形態(tài)，其貼壁生長狀態(tài)和增殖速度也與凍存前無差異；生長特性鑒定結果顯示，第65代劍尾魚腦細胞系細胞的群體倍增時間為43.048h，60代胚胎細胞的群體倍增時間為38.49h，表明細胞的生長分裂依然十分旺盛。染色體分析結果顯示，劍尾魚腦細胞和胚胎細胞特征性染色體數目為48條，表明所建立的細胞系確為劍尾魚腦細胞系和胚胎細胞系。
　　 (4)以劍尾魚腦細胞和胚胎細

9、胞為試驗材料，通過SYBRGreenⅡ實時熒光定量PCR方法檢測苯并(a)芘在不同劑量及作用時間下劍尾魚腦細胞和胚胎細胞GST、CYP1A1、CYP3A和P-gpmRNA的相對表達量，來研究苯并(a)芘對劍尾魚腦細胞和胚胎細胞的毒性效應。結果顯示：在腦細胞中，B(a)P對CYP1A1mRNA的相對表達量極顯著性誘導，存在很好的劑量一效應關系，而在時間上呈現抑制的效應；在本實驗設計濃度下，P-gpmRNA、GSTmRNA的相對表達量變化趨

10、勢與CYP3AmRNA一致，相對表達量隨著B(a)P濃度的增加而不斷下降，呈現出抑制的效應關系，而在時間上的效應關系無明顯的規(guī)律。胚胎細胞中，苯并(a)芘對胚胎細胞CYP1A1也是呈現強誘導效應，存在劑量一效應關系；在時間上，低濃度呈現抑制效應，高濃度組，呈現波動式的先抑制后誘導再強抑制的效應關系。B(a)P在時間和濃度上對P-gpmRNA、CYP3AmRNA的表達量均呈現抑制的效應，對GSTmRNA的表達量影響規(guī)律不明顯。劍尾魚腦細胞