TGR5對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響及機制.pdf

1、背景：隨著生活方式改變，心血管病的發(fā)病率呈逐年上漲趨勢。心室重構(gòu)是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的必經(jīng)之路，它是由多種損傷因素共同參與的結(jié)果，其中NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是重要一環(huán)。心臟組織是由心臟細(xì)胞及細(xì)胞外間質(zhì)共同組成，在心室重構(gòu)過程，心臟細(xì)胞中的心肌成纖維細(xì)胞起著重要作用。G蛋白偶聯(lián)受體(TGR5)作為一種膽汁酸膜受體，在多種組織、器官上均有表達，對機體的能量代謝、免疫調(diào)控等反應(yīng)過程起著重要的作用。已有研究表明在單核-巨噬細(xì)胞[1，2]、膽道

2、上皮細(xì)胞[3]、胃[4]等組織細(xì)胞膜上TGR5激動可減輕NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。但目前尚無相關(guān)研究明確TGR5激動對心肌成纖維細(xì)胞的影響。
　　目的：探究G蛋白偶聯(lián)受體(TGR5)激動對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）增殖的影響，并探討可能存在的機制。
　　方法：⑴乳小鼠CFs的培養(yǎng)與鑒定:使用酶消化及差速貼壁法培養(yǎng)CFs，免疫熒光鑒定CFs。⑵檢測TGR5 mRNA

3、在乳小鼠CFs的表達量:使用RT-PCR法檢測CFs及心臟、肝臟、脾臟組織上TGR5mRNA表達量。⑶TGR5過表達病毒制備與檢測。⑷檢測TGR5病毒對CFs的感染效率:實驗設(shè)置為實驗組:CFs-v+培養(yǎng)基組、CFs-v+ Polybrene組、CFs-v+ENi.S組、CFs-v+Polybrene+ENi.S組(CFs-v指成功感染TGR5過表達病毒的CFs，“+”指陽性病毒，“-”指陰性病毒）；對照組:CFs+培養(yǎng)基組、CFs+P

4、olybrene組、CFs+ENi.S組、CF s+Polybrene+ENi.S組。⑸檢測TGR5過表達病毒感染后的CFs上TGR5 mRNA的表達情況:使用RT-PCR法檢測CFs、CFs-v(+)、心臟、肝臟、脾臟組織上TGR5 mRNA表達量。⑹檢測血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)、TGR5過表達病毒對CFs增殖的影響：AngⅡ?qū)嶒灧纸M設(shè)置為空白對照組:CFs+AngⅡ(0mol/L)組，AngⅡ干預(yù)組:CFs

5、+AngⅡ(10-5mol/L)組、CFs+AngⅡ(10-6mol/L)組、CFs+AngⅡ(10-7mol/L)組；TGR5實驗組設(shè)置為對照組:AngⅡ+CFs組，病毒干預(yù)組:AngⅡ+CFs-v(+)組、AngⅡ+CFs-v(-)組，使用MTT法檢測各組經(jīng)不同實驗條件干預(yù)后在不同時間點的OD值，計算細(xì)胞相對增殖或抑制率。⑺檢測過表達TGR5及激動TGR5后對CFs增殖的影響:實驗分組為CFs組；CFs-v(+)組；AngⅡ+CFs

6、-v(+)組；AngⅡ+CFs-v(-)組；AngⅡ+CFs-v(+)+諾米林（TGR5激動劑）組；AngⅡ+ CFs-v(-)+諾米林組，使用MTT法檢測各實驗組干預(yù)不同時間后的增殖情況，使用Western Blot技術(shù)檢測各實驗組TGR5、P65蛋白的相對表達量，使用ELISA技術(shù)檢測各實驗組的cAMP、膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ含量。
　　結(jié)果：①CFs培養(yǎng)成功，熒光免疫法檢測CFs純度大于90％。②RT-PCR結(jié)果:正常情況下TGR5

7、 mRNA在乳小鼠CFs上的表達量極少，CFs組TGR5 mRNA表達量明顯少于心臟組、肝臟組、脾臟組，顯著差異(P＜0.05); CFs-v(+)組TGR5 mRNA表達量較CFs組明顯升高，P＜0.05。③MTT結(jié)果:不同濃度的AngⅡ?qū)Fs均具有促增殖作用，AngⅡ+CFs組的促增殖作用明顯強于CFs組(P＜0.05)，而10-7mol/L AngⅡ誘導(dǎo)24小時的促進增殖作用最強。感染TGR5過表達病毒后，與CFs組抑制細(xì)胞增殖

8、作用比較，CFs-(+)組抑制細(xì)胞增殖作用明顯增強，P＜0.05。激動TGR5后，與AngⅡ+CFs-v(+)組抑制細(xì)胞增殖作用比較，AngⅡ+CFs-v(+)+諾米林組的抑制細(xì)胞增殖作用明顯增強，P＜0.05；④Western Blot結(jié)果：感染TGR5后，與CFs組比較，CFs-v(+)組、AngⅡ+ CFs-v(+)組、AngⅡ+ CFs-v(+)+諾米林組上的TGR5蛋白表達量均明顯增高，P＜0.05；感染TGR5病毒后，與CF

9、s組比較，CFs-v(+)組上的P65蛋白表達量明顯減少，P＜0.05;激動TGR5后，與AngⅡ+ CFs-v(+)組比較，AngⅡ+CFs-v(+)+諾米林組的P65蛋白表達量明顯減少，P＜0.05。⑤ELISA結(jié)果：感染TGR5病毒后，與CFs-v組比較，CFs-v(+)組胞漿中cAMP濃度明顯升高，P＜0.05;激動TGR5后，與AngⅡ+CFs-v(+)組比較，AngⅡ+ CFs-v(+)+諾米林組胞漿中cAMP濃度較高， P

10、＜0.05；AngⅡ誘導(dǎo)后，與CFs-v(+)組比較，AngⅡ+ CFs-v(+)組細(xì)胞合成分泌的膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ量增多，P＜0.05;感染TGR5病毒后，與CFs組比較，CFs-v(+)組細(xì)胞合成分泌的膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ量減少;激動TGR5后，與AngⅡ+CFs-v(+)組比較，AngⅡ+ CFs-v(+)+諾米林組細(xì)胞合成分泌的膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ量明顯減少，P＜0.05。
　　結(jié)論：⑴TGR5 mRNA在小鼠CFs上的表達量極少。⑵激動