空間距離在胸腺基質(zhì)細(xì)胞培訓(xùn)胸腺細(xì)胞中的關(guān)鍵作用.pdf

1、背景及目的：胸腺是培訓(xùn)胸腺細(xì)胞發(fā)育的首要場(chǎng)所，來(lái)源于骨髓的前T細(xì)胞進(jìn)入胸腺環(huán)境中，從胸腺被膜下區(qū)，經(jīng)胸腺皮質(zhì)向皮質(zhì)皮髓交界區(qū)、髓質(zhì)移動(dòng)，經(jīng)一系列復(fù)雜的培訓(xùn)過(guò)程，包括增殖、受體基因重排、MHC限制的陽(yáng)性選擇、排除自身反應(yīng)性和缺陷細(xì)胞的陰性選擇、細(xì)胞表面分子和功能上的成熟等，確保了外周成熟T細(xì)胞可識(shí)別外源性抗原肽和自身MHC復(fù)合物(自身MHC限制性)，并消除自身反應(yīng)性T細(xì)胞(自身耐受)。這個(gè)過(guò)程中每一步都是在胸腺的微環(huán)境中進(jìn)行，胸腺微環(huán)境主

2、要由胸腺基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，其中胸腺基質(zhì)細(xì)胞是胸腺微環(huán)境中最重要的成分。胸腺基質(zhì)細(xì)胞在胸腺中以三維立體構(gòu)成網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)，胸腺細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞在不同區(qū)域的相互作用對(duì)精密有序地完成了陽(yáng)性選擇和陰性選擇起重要的作用。胸腺基質(zhì)細(xì)胞在空間、時(shí)間上為胸腺細(xì)胞的培訓(xùn)提供了最適合的微環(huán)境，對(duì)胸腺細(xì)胞分化以及功能性亞群的形成有決定性的作用。 胸腺不僅在建立和塑造有功能的T細(xì)胞庫(kù)中發(fā)揮作用，而且對(duì)誘導(dǎo)和維持自身耐受和移植耐受起關(guān)鍵作用。經(jīng)胸腺途

3、徑誘導(dǎo)免疫耐受已進(jìn)行了廣泛研究，主要的機(jī)理是通過(guò)胸腺的選擇作用，消除自身、同種、異種供體反應(yīng)性T細(xì)胞，從而達(dá)到較穩(wěn)定的免疫耐受。最近發(fā)現(xiàn)在胸腺基質(zhì)細(xì)胞廣泛地表達(dá)外周組織器官的組織特異性抗原，所以胸腺基質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是外周組織器官的自身抗原庫(kù)的鏡子，在自身耐受和維持免疫自身穩(wěn)定起著關(guān)鍵性作用。異種胸腺移植不僅可以重建有功能的細(xì)胞免疫功能，而且可以誘導(dǎo)供者特異性免疫耐受，但其面臨的主要問(wèn)題是宿主T細(xì)胞在異種胸腺內(nèi)成熟后不能產(chǎn)生對(duì)宿主抗原足夠的

4、自身耐受，而發(fā)生了多器官的自身免疫損害，如甲狀腺炎、淚腺炎、卵巢炎以及胃炎等，而同系或同種胸腺移植的受者未發(fā)生自身免疫綜合征。我們以前將同系胸腺與異種胸腺充分混后再進(jìn)行移植，既能誘導(dǎo)供體特異性的免疫耐受，又能防止自身免疫損害的發(fā)生。然而胸腺細(xì)胞在混合胸腺中是如何被訓(xùn)練的并不清楚；也不知道從骨髓來(lái)源的前T細(xì)胞進(jìn)入混合胸腺后，是一個(gè)克隆的T細(xì)胞經(jīng)歷混合胸腺中的一個(gè)胸腺培訓(xùn)，還是要經(jīng)歷兩個(gè)不同胸腺的共同培訓(xùn)?因此我們?cè)O(shè)計(jì)了將不同種類的兩種胸腺

5、分別移植在一個(gè)機(jī)體內(nèi)的不同部位，并進(jìn)行T細(xì)胞示蹤實(shí)驗(yàn)，以闡明T細(xì)胞在成熟、分化過(guò)程中是一個(gè)連續(xù)不斷的培訓(xùn)，還是在經(jīng)過(guò)一個(gè)胸腺培訓(xùn)后進(jìn)入外周，并能再次到另一處胸腺進(jìn)行第二次培訓(xùn)?這些基本問(wèn)題對(duì)我們理解T細(xì)胞發(fā)育和T細(xì)胞“再教育”具有重要意義。 方法 1.將不同類型胎胸腺移植到裸小鼠雙腎包膜下，建立胸腺基質(zhì)細(xì)胞培訓(xùn)T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?shí)驗(yàn)分組：DB組(同系胸腺移植組，雙腎包膜下移植BalB/C胎胸腺)；DC組(同種胸腺移植組，

6、雙腎包膜下移植C57BL/6胎胸腺)；DF組(異種胸腺移植組，雙腎包膜下移植F344胎胸腺)；DBF組(同系異種胸腺混合移植組，雙腎包膜下移植BalB/C+F344的混合胎胸腺)；DCF組(同種異種胸腺混合移植組，雙腎包膜下移植C57BL/6+F344的混合胎胸腺)；LBRF組(同系、異種胸腺分開(kāi)移植組，左腎包膜下移植BalB/C胎胸腺，右腎包膜下移植F344胎胸腺)；LCRF組(同種、異種胸腺分開(kāi)移植組，左腎包膜下移植C57BL/6胎

7、胸腺，右腎包膜下移植F344胎胸腺)。 2.利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了胸腺移植4月后裸小鼠外周血中CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+CD25+T細(xì)胞，了解胸腺移植后受者裸小鼠T細(xì)胞的重建情況。 3.胸腺移植6月后裸小鼠受體的脾細(xì)胞體外進(jìn)行ConA刺激和單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，了解胸腺移植后裸小鼠受體重建T細(xì)胞的免疫功能。 4.觀察移植胸腺存活情況與胸腺的體積大，利用組織學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察移植胸腺的結(jié)構(gòu)以及

8、受者骨髓源細(xì)胞在胸腺移植物內(nèi)的分布情況。 5.胸腺移植4月后，裸小鼠受體進(jìn)行皮膚移植實(shí)驗(yàn)，將正常BalB/C小鼠、C57BL/6小鼠、F344大鼠及SD大鼠的皮膚同時(shí)移植在受體裸小鼠背部，觀測(cè)其皮膚移植物的存活情況。 6.用間接熒光染色的方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中有無(wú)針對(duì)宿主胃組織的自身抗體，用ELISA法測(cè)血清中抗DNA抗體，并記錄各組動(dòng)物因自身免疫性病疾的死亡率。 7.用51Cr同位素標(biāo)記同系胸腺移植組和異種胸腺

9、移植組的T細(xì)胞，分別再輸注于LBRF組，48h和5d后，活殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取各臟器進(jìn)行同位素CPM測(cè)定，了解經(jīng)一個(gè)胸腺發(fā)育成熟的T細(xì)胞是否可以再循環(huán)到另一個(gè)胸腺中進(jìn)行再培訓(xùn)。 結(jié)果 1.各組胸腺移植物均存活良好，DB組、DC組、DF組、DBF組及DCF組兩側(cè)胸腺體積大小沒(méi)有明顯的差異，而LBRF組，右側(cè)的異種F344胸腺顯著較左側(cè)的同系BALB/c胸腺體積小，LCRF組雖然兩側(cè)胸腺體積上沒(méi)有明顯差別，但較DB組、DC組、DF

10、組、DBF組及DCF組的胸腺體積小。HE染色發(fā)現(xiàn)，移植胸腺具有正常的皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)。免疫組化染色顯示，單純異種胎胸腺移植中含有宿主MHCⅡ類抗原陽(yáng)性細(xì)胞，主要位于髓質(zhì)中，具有典型樹(shù)突樣外觀。 2.各組胸腺移植后均能夠有效重建受者裸小鼠外周血中的CD4+T，但外周血中CD3+CD8+T細(xì)胞明顯低于免疫健全BALB/c小鼠，CD4+CD25+T細(xì)胞DB組、DF組、LBRF組比正常BALB/c小鼠低(P＜0.05)，其余各組與正常BA

11、LB/c小鼠沒(méi)有顯著差異。 3.各組胸腺移植后受者脾細(xì)胞對(duì)ConA及無(wú)關(guān)來(lái)源的SD鼠脾細(xì)胞刺激的應(yīng)答均較強(qiáng)，而對(duì)自身BALB/c脾細(xì)胞刺激無(wú)顯著反應(yīng)，DC組、DF組、DBF組、DCF組分別對(duì)相應(yīng)胸腺供者來(lái)源的C57BL/6、F344、BALB/c與F344、C57BL/6與F344的脾細(xì)胞沒(méi)有增殖反應(yīng)，而LBRF組、LCRF組分別對(duì)相應(yīng)胸腺供者來(lái)源的脾細(xì)胞仍有反應(yīng)。 4.皮膚移植實(shí)驗(yàn)顯示，DB組：除對(duì)BalB/C皮膚不排

12、斥外，對(duì)其它皮膚均排斥；DC組對(duì)宿主BalB/C皮膚和胸腺供者來(lái)源的C57BL/6皮膚耐受，而對(duì)無(wú)關(guān)的F344及SD皮膚排斥；DF組與DBF組對(duì)宿主BalB/C皮膚及胸腺供者來(lái)源的F344皮膚耐受，而對(duì)無(wú)關(guān)的C57BL/6皮膚及SD皮膚排斥；DCF組對(duì)宿主BalB/C皮膚及胸腺供者來(lái)源的F344、C57BL/6皮膚耐受，而對(duì)無(wú)關(guān)的SD皮膚排斥；LBRF組只對(duì)宿主BalB/C皮膚耐受，而對(duì)胸腺供者來(lái)源的F344皮膚延遲排斥，對(duì)無(wú)關(guān)的C57

13、BL/6皮膚及SD皮膚排斥；LCRF組只對(duì)宿主BalB/C皮膚耐受，而對(duì)胸腺供者來(lái)源的F344及C57BL/6皮膚延遲排斥，對(duì)無(wú)關(guān)的SD皮膚排斥。 5.單純異種胸腺組(DF組)因自身免疫性病疾死亡率最高(70％)，其次是不同種類胸腺在不同部位分開(kāi)移植的LBRF組(45.5％)與LCRF組(33.3％)。各組的腎臟、肝臟、心臟以及肺臟等器官均未發(fā)現(xiàn)明顯的病理改變和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。但DF組、LBRF組及LCRF組胃組織有炎癥性損傷和淋

14、巴細(xì)胞浸潤(rùn)，其它組胃組織均未見(jiàn)明顯的炎性損害和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。DF組、LBRF組、LCRF組血清中有針對(duì)宿主胃組織的自身抗體和抗DNA抗體的相對(duì)滴度顯著增高，提示DF組、LBRF組、LCRF組有自身免疫性損害。 6.標(biāo)記51Cr的同系胸腺發(fā)育和異種胸腺發(fā)育的T細(xì)胞，分別再輸注于同系、異種胸腺分開(kāi)移植的LBRF組后，48h和5d后，主要分布在肝脾部位，也在兩種不同胸腺中分布，按每g組織內(nèi)含的51Cr標(biāo)記T細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，最高的是胸腺，其

15、次是脾臟與肝臟。 結(jié)論 1.實(shí)驗(yàn)成功建立了不同類型胸腺移植模型，通過(guò)胸腺移植可有效重建受者裸小鼠功能性胸腺細(xì)胞。 2.同系或同種胸腺與異種胸腺混合移植可誘導(dǎo)胸腺供者來(lái)源的免疫耐受，不發(fā)生自身免疫性疾??；而同系或同種胸腺與異種胸腺分開(kāi)移植于同一裸鼠的不同部位后不能誘導(dǎo)對(duì)供者來(lái)源的移植物完全耐受，也不能防止自身免疫性疾病的發(fā)生，說(shuō)明空間距離在胸腺基質(zhì)細(xì)胞培訓(xùn)胸腺細(xì)胞中起關(guān)鍵作用。 3.胸腺混合移植誘導(dǎo)受者對(duì)供

16、者的完全耐受表明，一個(gè)克隆的T細(xì)胞肯定是在一次的程序化培訓(xùn)中同時(shí)經(jīng)兩種胸腺共同培訓(xùn)或經(jīng)提呈有另一個(gè)胸腺組織抗原的胸腺基質(zhì)細(xì)胞的培訓(xùn)；胸腺分開(kāi)移植誘導(dǎo)受者對(duì)供者的不完全耐受，表明從一個(gè)胸腺發(fā)育的T細(xì)胞只有部分會(huì)再經(jīng)過(guò)另一個(gè)胸腺的培訓(xùn)。 4.經(jīng)一種胸腺培訓(xùn)的外周成熟T細(xì)胞可以返回自身的胸腺，也可以返回另一種胸腺中進(jìn)行再培訓(xùn)，返回胸腺的成熟T細(xì)胞可能增強(qiáng)陰性選擇，可能與免疫耐受有關(guān)。胸腺基質(zhì)細(xì)胞對(duì)未成熟的前T細(xì)胞培訓(xùn)比對(duì)成熟T細(xì)胞的培