白介素6信號調(diào)控胚胎造血干細(xì)胞生成與發(fā)育的機(jī)制研究.pdf

1、造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)是一種具有分化為全血系列成熟細(xì)胞，并且具有自我更新，維持個(gè)體終生造血能力的多潛能性干細(xì)胞，其生成與發(fā)育過程受不同微環(huán)境調(diào)控，受多種轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子及表觀調(diào)控因子，多種通路構(gòu)成的信號網(wǎng)絡(luò)有規(guī)律的協(xié)同調(diào)控。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的任何一個(gè)節(jié)點(diǎn)失衡或變異，都可能造成病態(tài)造血，甚至進(jìn)展為骨髓衰竭癥或白血病等。調(diào)控HSCs生成的機(jī)制研究越完善，越有利于體外利用多潛能性祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化為造

2、血干細(xì)胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)所需的HSCs，但目前為止，該目標(biāo)人類依然未能實(shí)現(xiàn)，其部分原因是對HSCs生成所需的內(nèi)在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分子及其機(jī)制了解仍然不夠明確完整。
　　本論文將分兩部分研究內(nèi)容展開論證：1）IL6與IL6R信號調(diào)控胚胎HSCs生成、增殖與分化發(fā)育;2）IL6與IL6R信號調(diào)控HSCs生成與發(fā)育的機(jī)制研究。
　　第一章:IL6與IL6R信號

3、調(diào)控胚胎HSCs生成、增殖與分化發(fā)育
　　目的：研究IL6與Il6R信號在調(diào)控胚胎HSCs生成、增殖與向淋巴細(xì)胞、髓系細(xì)胞分化發(fā)育中的作用。
　　方法：首先構(gòu)建造血系列特征性標(biāo)記基因部分序列到pEASY-T3載體上，再用ApaⅠ或SalⅠ限制性核苷酸內(nèi)切酶將環(huán)狀質(zhì)粒線性化，純化后以此為模板體外轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)基因mRNA對應(yīng)的反義探針;通過靶向性Morpholino(MO)敲降目的基因IL6與IL6R正常轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，達(dá)到阻斷該

4、信號的作用，陰性對照組用參考文獻(xiàn)中Standard MO(Std MO);利用cd41∶eGFP轉(zhuǎn)基因胚胎探索IL6與IL6R MO的最佳作用濃度，Std MO組參考文獻(xiàn)報(bào)道工作濃度;利用整胚原位雜交(whole embryonic in situ hybridization，WISH)實(shí)驗(yàn)、普通熒光顯微鏡與激光共聚焦體層掃描成像(confocal array)實(shí)驗(yàn)，與對照組相比，觀察實(shí)驗(yàn)組不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)(hours postferti

5、lization，hpf)胚胎的主動(dòng)脈腹側(cè)壁(the floor of dornal aorta，DA)runx1、cmyb陽性細(xì)胞數(shù)目，cmyb與kdr1雙陽性細(xì)胞的數(shù)目，尾部造血組織(tailor hematopoietic tissue，CHT)cd41陽性細(xì)胞數(shù)，胸腺rag1與lck陽性細(xì)胞數(shù)，軀干及CHT區(qū)lyz陽性細(xì)胞數(shù)目的變化情況。此外，利用公共測序數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分析，明確造血內(nèi)皮細(xì)胞(hematopoietic endot

6、helials，HEs)與不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)及成體HSCs內(nèi)IL6與IL6R、GP130的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1）本論文成功構(gòu)建系列目的基因載體并合成其反義探針（包括runx1，cmyb,gata1a,pu.1,mpx,1-plastin,rag1,rag2,lmo2,sc1,kdrl,efnb2a,dlc，foxn1，csf1ra，ikzf1，gata2b，il6，il6r，gp130);2)本研究確定最佳工作工作濃度為IL6MO

7、為0.6mM，IL6R MO為0.4mM，Std MO為0.2mM，顯微注射量為1nl，注射時(shí)間范圍是同胞受精卵1-2細(xì)胞期;3）與36hpf的Std MO組相比，同期IL6與IL6R MO組DA腹側(cè)壁內(nèi)或附近c(diǎn)myb陽性細(xì)胞顯著減少，兩組具有該表型胚胎數(shù)目超過75％;同時(shí)，我們觀察到在48hpf的胚胎DA區(qū)腹側(cè)壁內(nèi)HSCs（cmyb+kdrl+）細(xì)胞數(shù)目較對照組減少約50％(P＜0.001);24與28hpf的WISH結(jié)果顯示，IL6

8、與IL6R MO組DA腹側(cè)壁內(nèi)runx1陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，具有該表型胚胎數(shù)目顯著增多（70％以上）;72hpf轉(zhuǎn)基因胚胎實(shí)驗(yàn)組CHT區(qū)cd41∶eGFP陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，具有該表型的胚胎數(shù)顯著增加約50％;4)96hpf胚胎的WISH結(jié)果顯示，IL6與IL6R MO組胸腺rag1細(xì)胞幾乎缺乏，陽性胚胎數(shù)目超過95％，同期轉(zhuǎn)基因胚胎成像顯示，實(shí)驗(yàn)組胸腺lck∶GFP陽性細(xì)胞較對照組缺乏或顯著減少，陽性表型胚胎數(shù)目超過80％;72hpf

9、轉(zhuǎn)基因胚胎成像顯示，實(shí)驗(yàn)組軀干及CHT區(qū)lyz∶dsRed陽性細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P＜0.0001);5)單細(xì)胞RNA測序結(jié)果二次分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜IL6R與其共受體GP130在從HEs到HSCs發(fā)育過程中表達(dá)水平逐漸增高，到成體HSC時(shí)表達(dá)最高，而IL6表達(dá)水平太低而無法檢測到。
　　結(jié)論：1）IL6與IL6R信號被阻斷，36與48hpf胚胎DA區(qū)cmyb陽性細(xì)胞或HSCs數(shù)目顯著降低，提示該信號是DA區(qū)HSCs維持的必要條件;HS

10、Cs是由HEs轉(zhuǎn)分化而來(endothelial-to-hematopoietic transition，EHT)，利用WISH法證實(shí)早HSCs生成早期(24-28hpf)DA區(qū)腹側(cè)壁runx1陽性細(xì)胞因IL6與IL6R信號被阻斷而顯著減少，說明該信號在調(diào)控EHT起始過程中非常重要。CHT區(qū)（類似于胎鼠肝臟）是HSCs增殖，獲得自我更新能力的重要微環(huán)境，阻斷IL6與IL6R信號，該區(qū)域HSCs增殖能力顯著下降;2）阻斷該信號，96hpf

11、胸腺rag1、lck陽性細(xì)胞顯著減少，72hpf軀干lyz陽性細(xì)胞顯著減少，提示HSCs向淋巴細(xì)胞與髓系細(xì)胞分化發(fā)育同樣依賴IL6與IL6R信號;3）HEs與HSCs均表達(dá)膜Il6R/GP130共受體，暗示HSCs生成與發(fā)育直接受到該信號的調(diào)控，但I(xiàn)l6表達(dá)極低，提示其可能通過旁分泌來發(fā)揮作用的。
　　第二章:IL6與IL6R信號調(diào)控HSCs生成與發(fā)育的機(jī)制研究
　　目的：探索Il6可能分泌來源細(xì)胞，與調(diào)控HSCs發(fā)育經(jīng)典信

12、號Notch1a的功能關(guān)系;探索該信號是否通過調(diào)控血管發(fā)育間接影響HSCs生成;探索阻斷該信號是否引起HSCs凋亡，而非通過抑制EHT過程。
　　方法：利用同源重組法將斑馬魚胚胎Il6R基因編碼序列(CDS)構(gòu)建到PCS2+質(zhì)粒上，用NotⅠ限制性核酸內(nèi)切酶線性化該質(zhì)粒，后者作為體外合成Il6r mRNA的模板;Notch1a靶向抑制劑DAPT加入胚胎孵育液holt buffer中，作用時(shí)間為14至48hpf，作用濃度參考文獻(xiàn)報(bào)道

13、用100μM;Il6R mRNA注射到單細(xì)胞胚胎卵黃囊處，分別注射50pg、100pg，150pg，200pg與250pg每胚胎，共五組用于探索其最佳作用濃度;利用標(biāo)記gata1a、mpx、1-plastin探針及mpeg1∶eGFP轉(zhuǎn)基因胚胎檢測阻斷IL6與IL6R信號對應(yīng)原始造血紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞發(fā)育是否受到影響;阻斷該信號觀察tp1∶eGFP（Notch1a分子標(biāo)記）與kdrl∶mCherry（標(biāo)記動(dòng)靜脈）胚胎DA區(qū)雙陽

14、性細(xì)胞數(shù)目的變化;利用標(biāo)記kdrl、efnb2a、dlc探針檢測血管發(fā)育是否受到影響;利用TUNEL免疫熒光法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞與HSCs是否因阻斷該信號而發(fā)生凋亡;利用流式細(xì)胞術(shù)分選mpx與mpeg1∶eGFP細(xì)胞，用一步法定量PCR檢測其il6，il6r與gp130的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1)IL6R CDS序列成功構(gòu)建到質(zhì)粒PCS2+上，并合成IL6R mRNA;2)與Std MO組相比，IL6與IL6R MO組的24hpf胚

15、胎ICM(intermediate cell mass)區(qū)gata1a陽性原始紅細(xì)胞在并未受到顯著影響、28hpf胚胎在軀干及PBI(posterior blood island)區(qū)mpx陽性原始中性粒細(xì)胞與1-plastin陽性原始髓系細(xì)胞數(shù)目顯著減少，但32-36hpf胚胎mpeg1∶eGFP細(xì)胞組織分布與數(shù)目均未發(fā)生顯著變化(P＞0.05);3)阻斷IL6與IL6R信號，32-36hpf胚胎DA區(qū)腹側(cè)壁tp1+kdrl+雙陽性細(xì)胞

16、數(shù)目并未發(fā)現(xiàn)顯著變化(P＞0.05)，但當(dāng)DAPT阻斷Notch1a信號時(shí)，48hpf胚胎DA區(qū)cmyb陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，該表型胚胎比例約75％以上，但若同時(shí)注射Il6r mRNA200pg每枚胚胎后，cmyb細(xì)胞缺失的表型被拯救，效率約30％;與此相似，DAPT抑制72hpf胚胎CHT區(qū)cd41∶eGFP陽性細(xì)胞增殖，而Il6r mRNA200pg后可部分逆轉(zhuǎn)其表型，拯救效率約30％;4）與Std MO組相比，Il6與Il6r MO

17、組28hpf胚胎DA區(qū)kdrl、efnb2a與dlc血管標(biāo)記并未發(fā)現(xiàn)顯著變化;30hpf胚胎DA區(qū)血管TUNEL與fli1a∶eGFP雙陽性細(xì)胞并未顯著增加;5)與整胚相比，原始中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞均顯著高表達(dá)il6與il6r，但巨噬細(xì)胞gp130表達(dá)并無顯著增高。
　　結(jié)論：1）IL6與IL6R調(diào)控原始中性粒細(xì)胞的生成發(fā)育，但未發(fā)現(xiàn)顯著影響原始巨噬細(xì)胞發(fā)育，推測中性粒細(xì)胞可能通過自分泌Il6促進(jìn)自身發(fā)育，也可能通過旁分泌IL6作