MCF7細胞中haS-miR-103靶向CARM1基因的初步研究.pdf

1、隨著現(xiàn)在社會的不斷進步，人們生活方式、飲食習慣以及環(huán)境因素的變化，我國乳腺癌發(fā)病率在近30年中每年約增長2％-3％，成為威脅女性健康的“頭號癌癥殺手”，衛(wèi)生部已將乳腺癌列為我國腫瘤防治的重點之一。乳腺癌表現(xiàn)為乳房腫塊、乳頭溢液、乳頭凹陷;乳頭瘙癢、脫屑、糜爛、潰瘍、結痂等乳頭改變，形態(tài)上可以出現(xiàn)酒窩征、“橘皮征”等，并出現(xiàn)淋巴結腫大。乳腺癌容易出現(xiàn)遠處轉移，以肺、胸膜、骨、腦、肝轉移多見。
　　 隨著miRNAs的發(fā)現(xiàn)及其在細胞

2、內的作用機制不斷深入研究，miRNAs在乳腺癌中的調控作用越來越受到重視，它能夠調節(jié)腫瘤細胞的生長和侵襲、轉移，在體內發(fā)揮著類似于癌基因和抑癌基因的作用。已經有實驗在子宮內膜癌細胞系中證明MicroRNA-103促進腫瘤生長與侵襲的作用。本實驗希望通過慢病毒介導的方法，將構建成功的pLVTHM-miR103載體轉染到對人乳腺癌MCF7細胞，并對miR103是否靶向于Carm1進行初步鑒定，為后續(xù)的功能學研究打下基礎，從而對最終的臨床干預

3、治療提供一定參考價值。
　　 目的:構建慢病毒載體pLVTHM-miR103，包裝慢病毒，測定滴度，鑒定miR103對Carm1的靶向作用。
　　 方法:實驗分為三部分。1.通過文獻挖掘找到在HER2(+)/(-)乳腺癌組織中表達不同的MicroRNAS，采用三種不同的生物信息預測軟件對其靶向的基因進行預測，找到可能性最大的靶基因CARM1。2.擴增hsa-miR-103的前體片段，與pLVTHM同時經過XhoⅠ和Not

4、Ⅰ雙酶切，使用T4 DNA連接酶連接入pLVTHM質粒中，測序正確后，將目的片段轉接于pLVTHM質粒，再次測序驗證。構建好的質粒與PMD2.G、psPAX2兩個輔助質粒使用脂質體2000導入293T細胞，包裝出慢病毒。同時進行慢病毒滴度測定。3.pLVTHM-miR103慢病毒的獲取及MCF7細胞中miR-103與融合基因CARM1靶向關系的初步鑒定。
　　 結果:通過自行設計引物，以正常人全血基因組DNA為模板，利用PCR技

5、術成功克隆了表達hsa-miR-103的基因片段，經測序驗證正確;成功構建了表達hsa-miR-103的重組慢病毒質粒pLVTHM-miR-103，該重組質粒能在細胞內穩(wěn)定特異地表達hsa-miR-103，并獲取了慢病毒上清，具備再感染目的細胞的能力;利用所獲得的慢病毒上清感染MCF7細胞，并利用實時熒光RT-PCR與westem blotting對感染后MCF7細胞中hsa-miR-103及CARM1表達情況進行了檢測。