熊果酸通過p38MAPK-IGFBP1-FOXO3a通路抗肝癌細(xì)胞生長的作用機(jī)制.pdf

1、目的:
　　1.體外實(shí)驗(yàn)探討熊果酸(ursolic acid，UA)對人肝癌HepG2、Bel-7402細(xì)胞生長抑制的分子作用機(jī)制。
　　2.動物實(shí)驗(yàn)探討熊果酸對人肝癌HepG2裸鼠移植瘤生長和對肝癌裸鼠移植瘤相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，初步了解熊果酸體內(nèi)抗肝癌機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用四甲基偶氮甲唑鹽比色(MTT)方法檢測UA對Bel-7402肝癌細(xì)胞的24h，48 h和72 h的細(xì)胞生存率作用。同時(shí)觀察UA對多

2、種肝癌絀胞的抑制作用。采用流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)檢測UA對Bel-7402和HepG2肝癌細(xì)胞24h周期的影響;蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot，WB)法檢測UA對Bel-7402和HepG2肝癌細(xì)胞p38MAPK磷酸化蛋白的表達(dá);劑量依賴性的檢測UA作用于Bel-7402和HepG2肝癌細(xì)胞24h FOXO3a、IGFBP1蛋白表達(dá)情況;然后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測IGFBP1

3、 mRNA表達(dá)水平;雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測UA對Bel-7402和HepG2肝癌細(xì)胞IGFBP1啟動子活性;采用p38MAPK抑制劑SB203580，進(jìn)一步研究UA通過p38MAPK對FOXO3a、IGFBP1蛋白表達(dá)的影響以及對IGFBP1啟動子活性的作用。采用沉默（RNA干擾）和過表達(dá)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，研究UA對肝癌的細(xì)胞生長抑制作用以及對FOXO3a、IGFBP1蛋白表達(dá)的影響;
　　2.體內(nèi)藥效研究，帶熒光素酶

4、的HepG2細(xì)胞造肝癌裸鼠腋下移植瘤模型，成瘤后，根據(jù)裸鼠體重與腫瘤體積的大小，進(jìn)行隨機(jī)化分組，然后將其分為三組:空白對照組;熊果酸低劑量組（25 mg.kg-1.d-1，腹腔注射，連續(xù)用藥30天）;熊果酸高劑量組(50 mg.kg-1.d-1，腹腔注射，連續(xù)用藥30天)。用小動物活體成像技術(shù)觀察給予熊果酸低劑量和高劑量處理后移植瘤體重?zé)晒馑孛笜?biāo)記的HepG2細(xì)胞增殖情況:到達(dá)作用時(shí)間后，測量腫瘤體積、腫瘤大小和稱量裸鼠、腫瘤的重量。提

5、取腫瘤組織蛋白后，采用Western bolt法觀察高劑量熊果酸處理后裸鼠移植瘤組織p-p38MAPK、FOXO3a和IGFBP1蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　體外實(shí)驗(yàn):
　　1.MTT法結(jié)果表明，熊果酸對肝癌細(xì)胞Bel-7402具有顯著性的抑制作用，呈劑量依賴性，和對照組比較，濃度在15～30μM時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。24h熊果酸的IG0=23.04±0.68μM，48 h的IC50=22.84

6、5±0.875μM，72 h的IC50=21.525±1.245μM。熊果酸對多種肝癌細(xì)胞包括HepG2、Bel-7402、QJY-7703、MHCC97L和MHCC97H，在一定的時(shí)間和劑量下具有不同的抑制效果，和對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)OXO3a可以逆轉(zhuǎn)熊果酸對Bel-7402、HepG2肝癌細(xì)胞的生長抑制作用。沉默IGFBP1可以逆轉(zhuǎn)熊果酸對Bel-7402、 HepG2肝癌細(xì)

7、胞的生長抑制作用。先沉默IGFBP1，然后再過表達(dá)IGFBP1，可以修復(fù)熊果酸對Bel-7402、HepG2肝癌細(xì)胞的生長抑制作用，加藥組和未轉(zhuǎn)染加藥組之間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)熊果酸可誘導(dǎo)Bel-7402、HepG2肝癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。在Bel-7402細(xì)胞中，G0/G1期細(xì)胞比例在20μM、25μM處理時(shí)上升，20～25μM UA在G0/G1期百分率分別為73.968±2.

8、24和77.81±2.49。在HepG2細(xì)胞中，G0/G1期細(xì)胞比例在5μM、20μM和25μM處理時(shí)上升，5～25μM UA在G0/G1期百分率分別為60.19±0.42、74.89±1.32和75.06±1.32，與對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　3.Westernblot法檢測蛋白表達(dá)結(jié)果顯示熊果酸可以時(shí)間依賴性的增加p38MAPK的磷酸化。對于Bel-7402和HepG2肝癌細(xì)胞，熊果酸24 h可以劑量依賴

9、性的增加IGFBP1、FOXO3a蛋白的表達(dá)，和對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4.qRT-PCR法檢測在Bel-7402、HepG2肝癌細(xì)胞中，熊果酸可以增加IGFBP1 mRNA的基因表達(dá)量，和對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　5.雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測在Bel-7402、HepG2肝癌細(xì)胞中，熊果酸可以增強(qiáng)IGFBP1啟動子的活性，和對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.0

10、5)。
　　6.Western blot法和雙熒光素酶報(bào)告基因法結(jié)果顯示給予p38MAPK抑制劑干預(yù)可以阻斷熊果酸導(dǎo)致Bel-7402和HepG2肝癌細(xì)胞中IGFBP1、FOXO3a的上調(diào)以及IGFBP1啟動子活性的增加。熊果酸單獨(dú)給藥組和熊果酸聯(lián)合抑制劑組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。在肝癌Bel-7402、HepG2細(xì)胞中，沉默IGFBP1基因可以逆轉(zhuǎn)熊果酸對FOX03a的上調(diào)影響，而沉默F(xiàn)OXO3a基因，并不能逆

11、轉(zhuǎn)熊果酸對IGFBP1的上調(diào)影響。
　　7.細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法和Western blot法結(jié)果表明在Bel-7402、HepG2肝癌細(xì)胞中，過表達(dá)IGFBP1基因可以增強(qiáng)熊果酸對p-p38MAPK、FOXO3a的上調(diào)影響，過表達(dá)FOXO3a基因可以增強(qiáng)熊果酸對p-p38MAPK的上調(diào)影響，給藥組和未轉(zhuǎn)染給藥組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，但對IGFBP1的作用無明顯影響。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　1.動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

12、明，與對照組相比，高劑量熊果酸組能使HepG2移植瘤裸鼠的瘤體和瘤重變小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。對裸鼠重量無明顯變化，因此，熊果酸在體內(nèi)亦能抑制HepG2肝癌細(xì)胞的生長。
　　2.在HepG2移植瘤裸鼠腫瘤組織中，高劑量熊果酸可以增強(qiáng)p-p38MAPK、FOXO3a和IGFBP1蛋白的表達(dá)，和對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.體外實(shí)驗(yàn)表明，熊果酸可以通過活化p38MAP

13、K激酶途徑，從而增加Bel-7402、HepG2肝癌細(xì)胞中IGFBP1和轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a蛋白的表達(dá)，并且可以使Bel-7402、HepG2細(xì)胞停滯于G0/G1期。同時(shí)，增加p38MAPK磷酸化可以增強(qiáng)IGFBP1和FOXO3a蛋白的表達(dá)。過表達(dá)IGFBP1和FOXO3a可以反饋協(xié)同熊果酸對p38MAPK的刺激作用，此反饋調(diào)節(jié)環(huán)路進(jìn)一步提示IGFBP1和FOXO3a的表達(dá)在介導(dǎo)熊果酸抑制肝癌細(xì)胞生長機(jī)制中的重要作用;
　　2.通