油脂合成過程中甘油三磷酸脫氫酶基因及乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆與鑒定.pdf

1、脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物是人類營養(yǎng)三大要素。如果在食物中長(zhǎng)期缺乏脂肪，將引起嚴(yán)重的機(jī)能混亂并喪失勞動(dòng)能力。植物油脂是人類在日常生活中取得脂肪的主要來源之一，對(duì)人體健康具有重大意義。植物油脂不僅被廣泛用于人類飲食方面，而且是重要的工業(yè)原料，在制皂、橡膠、制革、染織、蠟燭、潤(rùn)滑油、合成樹脂、化妝品以及醫(yī)藥等工業(yè)，均需要植物油脂作為原料。
　　 植物油脂的儲(chǔ)存形式為三酰甘油(triacylglycerol，TAG)，對(duì)人類有著巨大的營

2、養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)意義。世界主要的油料作物包括大豆、棕櫚、油菜和葵花籽等，其年產(chǎn)油量達(dá)到1億噸，而且部分油料作物如油菜籽等的產(chǎn)油量更是逐年遞增。這些作物所產(chǎn)的油主要用于食用及化工行業(yè)。而且隨著化石能源的環(huán)境污染和資源日益匱乏，油脂在生物柴油方向的需求量也日益增加。
　　 植物油脂在未來的經(jīng)濟(jì)上的重要性及其可再生的優(yōu)勢(shì)非常明顯，對(duì)未來能源及環(huán)境有著極其深遠(yuǎn)的意義。利用有限的土地資源增加植物油脂的產(chǎn)量是我們的目標(biāo)，這可以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過

3、對(duì)油脂合成中關(guān)鍵酶基因的改造和優(yōu)化從來增加油脂產(chǎn)量。研究表明，超表達(dá)油脂合成中的關(guān)鍵酶基因，比如甘油三磷酸脫氫酶(Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase，GPDH)，ACCase(乙酰輔酶A羧化酶)等能夠提高植物中的油脂產(chǎn)量。因此我們將從油脂產(chǎn)量較高的馬鈴薯致病疫霉(Phytophthora infestans)和強(qiáng)壯前溝藻(Amphidinium carterae)中克隆這些相關(guān)酶基因，并將其中的甘油三磷

4、酸脫氫酶(Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase，GPDH)基因轉(zhuǎn)入酵母及模式植物擬南芥中，并成功驗(yàn)證了其功能。結(jié)果如下：
　　 (1)通過對(duì)已測(cè)序的馬鈴薯致病疫霉基因組的分析得到一個(gè)可能具有甘油三磷酸脫氫酶(PinGPDH)活性的基因序列，對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)其同源性和已克隆并驗(yàn)證功能的其它物種的GPDH有較高的同源性。進(jìn)化樹分析也證明其進(jìn)化地位與擬南芥等植物相似，因而同源性也比較高。

5、>　　 (2)在馬鈴薯致病疫霉中同源克隆到了這個(gè)甘油三磷酸脫氫酶的cDNA，命名為PinGPDH1。將其轉(zhuǎn)入酵母不具甘油三磷酸脫氫酶活性的突變體△gpd1中，通過抗鹽實(shí)驗(yàn)及其甘油含量測(cè)定證明其在酵母中行使了功能，具備甘油三磷酸脫氫酶活性。
　　 (3)將PinGPDH1轉(zhuǎn)入瞬時(shí)表達(dá)載體pCambia1300GFP中，進(jìn)行洋蔥表皮瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果顯示其在植物的胞質(zhì)中表達(dá)，因而它是胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的基因。
　　 (4)分別構(gòu)建了3

6、5s組成性啟動(dòng)子和Napin種子特異啟動(dòng)子的PinGPDH1表達(dá)載體，pCambia2300EC-PinGPDH1和pNapin-pinGPDH1。突變體中表達(dá)該基因，出現(xiàn)部分表型恢復(fù)，初步證明其可在擬南芥中正確表達(dá)。
　　 (5)同樣的方法得到馬鈴薯致病疫霉中的一個(gè)可能的ACCase基因，命名為PinACCase1，分析并通過重疊延伸PCR技術(shù)得到大概3Kb的片段，其中包含其典型的ACCase的BC結(jié)構(gòu)域。
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