擬南芥AtMEK5相互作用蛋白的篩選及AtMAPK3-AtMAPK6對AtPLC2的體外磷酸化分析.pdf

1、植物中的MAPK級聯(lián)信號系統(tǒng)(mitogen-activated bprotein kinase cascade)參與激素信號、生物脅迫、細胞分裂和植物生長發(fā)育等生理過程的調(diào)節(jié)。MAPK級聯(lián)系統(tǒng)由MPKKK,MAPK和MAPK組成。磷酸化激活的MAPK可通過對下游底物分子的磷酸化，最終使外界或胞內(nèi)信號得以傳遞。在擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中，AtMEK5的持續(xù)激活突變體(AtMEK5<'DD>)蛋白的誘導表達，可以激活內(nèi)源的AtMPK6和AtMP

2、K3，最終引起細胞死亡的發(fā)生。我們通過酵母雙雜交對AtMEK5介入的級聯(lián)系統(tǒng)的下游底物進行了篩選，用激酶體外磷酸化的方法研究該級聯(lián)系統(tǒng)對AtPLC2的磷酸化。 用酵母雙雜交系統(tǒng)從擬南芥的cDNA文庫中篩選到近95個可能的陽性克隆在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基上生長且濾紙顯藍色，測序近40個，其中28個讀碼框正確參與的信號通路中的其它相關(guān)蛋白，再經(jīng)酵母雙雜交重復驗證排除假陽性克隆，得到10個陽性克隆。用酵母雙

3、雜交對克隆的多個MAPKK和MAPK進行互作實驗，確證了AtMEK5可與AtMPK6、AtMPK3相互作用。 磷脂酶C(PLC)能使質(zhì)膜上的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解成1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DAG)兩個第二信使，DAG激活下游蛋白激酶，IP3則參與調(diào)控Ca<'2+>相關(guān)的信號過程。PLC參與了細胞中諸多生理過程和對外界刺激的反應(yīng)的信號調(diào)節(jié)。我們對酵母雙雜交篩選出的AtPLC2與AtMEK5、

4、AtMPK6和AtMPK3的作用進行了進一步的分析。結(jié)果證明，AtPLC2的C2結(jié)構(gòu)域與AtMEK5、AtMPK6和AtMPK3相互作用。AtPLC2、AtPLC2 ⊿100可以被激活的AtMPK3和AtMPK6體外磷酸化，推測磷酸化位點或與磷酸化關(guān)系密切的部分是AtPLC2的X區(qū)域。 目前，植物PI-PLC家族的功能研究還很缺乏，未見植物PLC直接受MAPK調(diào)控的相關(guān)報道。我們的研究結(jié)果對于研究植物MAPK級聯(lián)系統(tǒng)的功能及植物