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文檔簡介
1、西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)Mantsum.et Nakai]是一種重要的園藝作物,在世界上有4000多年的栽培歷史。西瓜作為國際貿(mào)易中新鮮水果的一個(gè)重要組成部分,因其具有香甜口味和芳香氣味而深受廣大消費(fèi)者喜愛。但是,真菌性病害經(jīng)常發(fā)生并且導(dǎo)致百萬公噸西瓜的損失,利用傳統(tǒng)的方法并不能有效地解決這一問題而且還帶來一些負(fù)面影響,例如環(huán)境污染、破壞土壤微生物。此外,西瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄常規(guī)的育種方法很難改變其特性。隨著
2、生物技術(shù)的發(fā)展,基因工程技術(shù)為改良品種提供了有效途徑。
本研究以西瓜自交系W1-4和W1-12為試材,建立了西瓜高效再生體系,并探討了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素,由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化率極低未能獲得轉(zhuǎn)化植株;本試驗(yàn)通過子房注射法成功將抗真菌病基因幾丁質(zhì)酶基因(CH5B)和β-1,3-葡聚糖酶基因(BG2)分別導(dǎo)入西瓜中,并對(duì)影響西瓜再生體系建立和子房注射法遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素進(jìn)行了探討,建立了西瓜自交系W1-4和W
3、1-12高效再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化條件,本研究為進(jìn)一步研究子房注射法轉(zhuǎn)基因技術(shù)在西瓜育種中的應(yīng)用提供了參考依據(jù),并為創(chuàng)造新的抗真菌病害西瓜品種提供種質(zhì)資源。主要內(nèi)容和結(jié)果包括:⑴建立了西瓜自交系W1-4和W1-12高效再生體系:最佳萌發(fā)培養(yǎng)基為1/8 MS添加瓊脂7.0 g·L-1、蔗糖30 g·L-1;最佳外植體來源兩片子葉仍重疊在一起尚未展開,子葉顏色剛剛由黃色轉(zhuǎn)為淺綠色時(shí)的無菌苗;最佳外植體為大小約0.5 cm×0.5 cm帶有上胚軸
4、的子葉節(jié);最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基W1-4和W1-12分別為MS+6-BA1.5 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1和MS+6-BA1.0 mg·L-1+IAA0.1 mg·L-1,芽伸長培養(yǎng)基為MS+6-BA0.05 mg·L-1;生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IAA0.1 mg·L-1。⑵構(gòu)建了pBI-BG2和pBI-CH5B植物表達(dá)載體。⑶確定了西瓜自交系W1-12抗性芽卡那霉素臨界篩選濃度為75 mg·L-1。⑷確定出西瓜自交系W
5、1-12農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化體系為:預(yù)培養(yǎng)2d,用OD600為0.5的工程菌液侵染15 min,在添加30 mg·L-1 AS的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d時(shí)轉(zhuǎn)化率最高為2.2%,但未獲得轉(zhuǎn)化植株。⑸確定了子房注射法遺傳轉(zhuǎn)化西瓜的最佳體系:外源DNA溶液濃度為750-1000μg·mL-1;外源DNA最佳導(dǎo)入時(shí)間是在西瓜白花授粉后的20h。⑹確定了田間西瓜植株子葉抗生素篩選濃度:西瓜自交系W1-4和W1-12子葉卡那霉素臨界篩選濃度有顯著的基
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