幾丁質酶和葡聚糖酶基因對西瓜遺傳轉化的研究.pdf

1、西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)Mantsum.et Nakai]是一種重要的園藝作物，在世界上有4000多年的栽培歷史。西瓜作為國際貿易中新鮮水果的一個重要組成部分，因其具有香甜口味和芳香氣味而深受廣大消費者喜愛。但是，真菌性病害經常發(fā)生并且導致百萬公噸西瓜的損失，利用傳統(tǒng)的方法并不能有效地解決這一問題而且還帶來一些負面影響，例如環(huán)境污染、破壞土壤微生物。此外，西瓜遺傳基礎狹窄常規(guī)的育種方法很難改變其特性。隨著

2、生物技術的發(fā)展，基因工程技術為改良品種提供了有效途徑。
　　 本研究以西瓜自交系W1－4和W1－12為試材，建立了西瓜高效再生體系，并探討了影響農桿菌介導法遺傳轉化的主要因素，由于農桿菌介導法遺傳轉化率極低未能獲得轉化植株；本試驗通過子房注射法成功將抗真菌病基因幾丁質酶基因(CH5B)和β-1，3－葡聚糖酶基因(BG2)分別導入西瓜中，并對影響西瓜再生體系建立和子房注射法遺傳轉化的主要因素進行了探討，建立了西瓜自交系W1－4和W

3、1－12高效再生體系和遺傳轉化條件，本研究為進一步研究子房注射法轉基因技術在西瓜育種中的應用提供了參考依據，并為創(chuàng)造新的抗真菌病害西瓜品種提供種質資源。主要內容和結果包括：⑴建立了西瓜自交系W1－4和W1－12高效再生體系：最佳萌發(fā)培養(yǎng)基為1/8 MS添加瓊脂7.0 g·L-1、蔗糖30 g·L-1；最佳外植體來源兩片子葉仍重疊在一起尚未展開，子葉顏色剛剛由黃色轉為淺綠色時的無菌苗；最佳外植體為大小約0.5 cm×0.5 cm帶有上胚軸

4、的子葉節(jié)；最佳不定芽誘導培養(yǎng)基W1－4和W1－12分別為MS+6-BA1.5 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1和MS+6-BA1.0 mg·L-1+IAA0.1 mg·L-1，芽伸長培養(yǎng)基為MS+6－BA0.05 mg·L-1；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IAA0.1 mg·L-1。⑵構建了pBI－BG2和pBI－CH5B植物表達載體。⑶確定了西瓜自交系W1-12抗性芽卡那霉素臨界篩選濃度為75 mg·L-1。⑷確定出西瓜自交系W

5、1－12農桿菌介導法遺傳轉化體系為：預培養(yǎng)2d，用OD600為0.5的工程菌液侵染15 min，在添加30 mg·L-1 AS的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d時轉化率最高為2.2％，但未獲得轉化植株。⑸確定了子房注射法遺傳轉化西瓜的最佳體系：外源DNA溶液濃度為750－1000μg·mL-1；外源DNA最佳導入時間是在西瓜白花授粉后的20h。⑹確定了田間西瓜植株子葉抗生素篩選濃度：西瓜自交系W1－4和W1－12子葉卡那霉素臨界篩選濃度有顯著的基