瓜蔞（Trichosanthes kirilowii）等中草藥纖溶酶的篩選、分離純化與cDNA克隆.pdf

1、活血化瘀中草藥具有“通利血脈，促進(jìn)血行，消散瘀血”等主要作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證明了活血化瘀中草藥可以改善血液的血流動(dòng)力學(xué)、血液流變學(xué)和微循環(huán)。目前已經(jīng)從多種生物體內(nèi)分離出來(lái)了能有效治療血栓性疾病的纖溶酶，多屬于絲氨酸蛋白酶類(lèi)。本文的研究目的是篩選出具有纖溶酶活性的中草藥品種，并對(duì)其進(jìn)行分離和性質(zhì)鑒定。 首先選取瓜萎等42種在臨床上具有活血化瘀作用的中草藥，水浸提物經(jīng)硫酸銨沉淀得到蛋白質(zhì)提取物，利用纖維蛋白平板法測(cè)定纖溶酶活性

2、，篩選具有纖溶酶活性的中草藥品種。結(jié)果表明，瓜萎、稀薟草、望江南、延胡索、益母草、竹節(jié)三七、牛膝、澤瀉的蛋白質(zhì)提取物具有明顯的體外纖溶酶活性。 將其中的牛膝、稀薟草水浸提物通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-Scpharose離子交換層析分離，得到的牛膝40％-4、稀薟草60％-1、稀薟草60％-2、稀薟草60％-3和稀薟草80％-2組分具有較高的纖溶酶比活力。 利用蛋白酶抑制劑對(duì)益母草纖溶酶提取物進(jìn)行處理，結(jié)果表明，苯甲

3、基磺酰氟、大豆胰蛋白酶抑制劑、糜蛋白酶抑制劑、苯甲脒能完全抑制益母草纖溶酶活性，EDTA、胃抑肽素、亮抑肽素、抑肽酶有部分抑制作用。認(rèn)為益母草纖溶酶屬于絲氨酸蛋白酶類(lèi)。 利用苯甲脒為配基、環(huán)氧氯丙烷活化的Sepharose 4B為載體，制備親和層析分離介質(zhì)。對(duì)益母草纖溶酶提取物進(jìn)行親和層析分離，得到具有纖溶酶活性、表觀分子量分別為60 kD和33 kD的蛋白質(zhì)組分。 纖維蛋白平板、Fibrin-PAGE檢測(cè)，新鮮瓜萎

4、蛋白提取物及瓜蔞蛋白提取物均具有纖溶酶活性。蛋白酶抑制劑實(shí)驗(yàn)表明，PMSF、大豆胰蛋白酶抑制劑可以完全抑制瓜萎纖溶酶的活性，苯甲脒、雞卵類(lèi)粘蛋白有一定的抑制作用，說(shuō)明瓜蔞纖溶酶屬于絲氨酸蛋白酶類(lèi)。用不同的蛋白質(zhì)作為作用底物，發(fā)現(xiàn)瓜萎纖溶酶提取物能夠有效降解纖維蛋白原和纖維蛋白，而對(duì)牛血清白蛋白、牛血紅蛋白、人免疫球蛋白基本無(wú)降解作用，表明該纖溶酶提取物毒副作用小。激活活性實(shí)驗(yàn)表明，瓜萎纖溶酶的纖溶酶原激活活性明顯高于其直接溶纖的活性，屬

5、于纖溶酶原激活劑。利用人工合成底物BAEE測(cè)定瓜蔞纖溶酶提取物，表明該物質(zhì)具有胰蛋白酶活性，分析認(rèn)為瓜萎纖溶酶是將纖溶酶原中Arg<,557>-Ile<,558>鍵斷裂，產(chǎn)生了纖溶酶。 由于大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)瓜萎纖溶酶的活性完全抑制，因此選用大豆胰蛋白酶抑制劑為配基，以環(huán)氧氯丙烷活化的Sepharose 4B為載體制備親和層析介質(zhì)，利用親和層析對(duì)新鮮瓜蔞蛋白提取物進(jìn)行了分離。得到了兩個(gè)具有活性的、表觀分子量分別為67 kD和