基于FAK-SRC-p130Cas通路探討青娥方影響骨吸收的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、目的:
　　闡明去卵巢大鼠與FAK/Src/p130Cas系統(tǒng)及下游信號關(guān)鍵因子的關(guān)系，從破骨細(xì)胞的分化和功能調(diào)節(jié)的角度揭示青娥方防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。
　　二、方法:
　　1在體實(shí)驗(yàn)
　　1.1動(dòng)物造模、分組、干預(yù)、取材:3月齡SPF級雌性SD大鼠120只，隨機(jī)分成4組:假手術(shù)組、單純?nèi)ヂ殉步M、去卵巢+骨疏康組和去卵巢+青娥方組，各30只。除假手術(shù)組外，其余3組行雙側(cè)卵巢結(jié)扎切除術(shù)。假手術(shù)組除未行

2、卵巢結(jié)扎切除外，其余步驟同其余3組。術(shù)后3天開始灌胃，去卵巢+骨疏康組給予骨疏康顆粒1.8g·kg-1·d-1，去卵巢+青娥方組給予青娥方浸膏0.62g·kg-1·d-1，假手術(shù)組和單純?nèi)ヂ殉步M以生理鹽水灌胃。用藥后4周、8周、12周每組分別處死10只，取血清、股骨、脛骨和腰椎骨備用。
　　1.2指標(biāo)檢測:ELISA法檢測血清E2、TRAP、BALP含量和尿DPD/Cr含量以觀察骨代謝的變化;雙能X射線骨密度儀檢測右股骨頸、右脛骨

3、上段以及腰4-6椎體密度;隨后應(yīng)用三點(diǎn)彎曲法行右股骨生物力學(xué)檢測，壓縮法行腰4椎體生物力學(xué)檢測;左股骨頸、左脛骨上段和腰3椎體制作石蠟切片，MASSON染色后行形態(tài)學(xué)分析骨小梁面積百分比;腰1椎體提取組織RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測FAK/Src/p130Cas系統(tǒng)及下游信號通路關(guān)鍵因子Crk、C3G和RAS的mRNA表達(dá)。腰2椎體提取組織蛋白，Western Blot法檢測FAK/Src/p130Cas系統(tǒng)及下游信號關(guān)鍵因子Crk

4、、C3G和RAS蛋白的表達(dá)。
　　2體外實(shí)驗(yàn)
　　2.1含藥血清制備:取3月齡SPF級雌性SD大鼠60只，分為青娥方組和空白組，各30只，青娥方組給予青娥方浸膏0.62g·kg-1·d-1，空白組給予生理鹽水2mL·d-1，連續(xù)灌胃7天，于最后一次灌胃后1h腹主動(dòng)脈無菌取血，凝固后離心取血清備用。
　　2.2細(xì)胞培養(yǎng)和指標(biāo)檢測:破骨細(xì)胞前體細(xì)胞株RAW264.7分為空白血清組和含藥血清組?？瞻捉M和青娥方組在50ng/m

5、L RANKL+30ng/mL MCSF誘導(dǎo)下，用梯度濃度含藥血清干預(yù)RAW264.7細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞，以選擇最佳血清濃度?？瞻捉M和青娥方組分別加入最佳濃度空白血清和青娥方含藥血清培養(yǎng):①干預(yù)2、4、6天，觀察RAW264.7細(xì)胞的存活率;②干預(yù)12、24小時(shí)后，提取細(xì)胞上清液，應(yīng)用ELISA法檢測PGE2、TNF-α和IL-6含量。RAW264.7細(xì)胞接種后分4組:空白組、青娥方組、空白+FAK抑制劑組和青娥+FAK抑制劑組，分別加

6、入最佳濃度空白血清和青娥方含藥血清以及FAK抑制劑，在50ng/mL RANKL+30ng/mL MCSF誘導(dǎo)下:①干預(yù)2、4、6天，觀察RAW264.7細(xì)胞分化破骨細(xì)胞;②干預(yù)12、24小時(shí)后，提取細(xì)胞RNA和蛋白，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western Blot法檢測FAK/Src/p130Cas系統(tǒng)及下游信號關(guān)鍵因子Crk、C3G和RAS的mRNA表達(dá)及蛋白的表達(dá)。
　　三、結(jié)果:
　　1、用藥后4、8、12周，單純?nèi)ヂ?/p>

7、巢組與假手術(shù)對照組相比，骨小梁纖細(xì)、斷裂、不完整，骨密度和骨生物力學(xué)指標(biāo)持續(xù)下降。血清E2含量持續(xù)下降，血清TRAP、BALP含量和尿DPD/Cr含量等骨代謝指標(biāo)均明顯升高，呈動(dòng)態(tài)變化。用藥后4周，F(xiàn)AK、p130Cas表達(dá)緩慢升高，第8周達(dá)到最高峰，12周有所回落。用藥后4周，SRC、CRK、C3G表達(dá)急劇升高，第8、12周逐漸降低，但仍比同期假手術(shù)期高。RAS表達(dá)呈現(xiàn)升高、降低、升高的“V”形變化。
　　2、青娥方干預(yù)可明顯增

8、加去卵巢大鼠的骨密度，提高骨生物力學(xué)性能，逆轉(zhuǎn)去卵巢導(dǎo)致的骨代謝指標(biāo)變化;降低去卵巢后骨組織FAK、SRC、p130Cas、CRK、C3G和RAS的表達(dá)。
　　3、RANKL+MCSF刺激增加破骨前體細(xì)胞FAK/SRC/ p130Cas及其下游信號分子CRK、C3G和RAS的RNA和蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。青娥方含藥血清能抑制破骨前體細(xì)胞的存活、分化，降低FAK/SRC/ p130Cas及其下游信號分子的RNA和蛋白表達(dá)。

9、
　　四、結(jié)論:
　　1、去卵巢大鼠術(shù)后早期FAK/SRC/p130Cas及下游分子即可出現(xiàn)高表達(dá)，隨時(shí)間推移呈現(xiàn)進(jìn)一步升高或降低的不同趨勢，但均高于假手術(shù)組。其變化時(shí)間早于有意義的BMD下降或骨代謝指標(biāo)，可作為絕經(jīng)后骨代謝預(yù)測和防治的參考指標(biāo)。
　　2、青娥方能明顯抑制骨組織FAK/SRC/p130Cas及下游分子的高表達(dá)，改善去卵巢后骨代謝水平，從而達(dá)到防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的目的。
　　3、青娥方抑制破骨細(xì)胞前