基于VEGF-VEGFR2-SRC信號通路探討補青顆粒對大鼠晶狀體氧化應激的保護作用研究.pdf

1、目的：
　　探討補青顆粒對紫外線照射所致的大鼠晶狀體氧化應激平衡狀態(tài)、對VEGF-VEGFR2-SRC信號通路表達的影響，為補青顆粒用于臨床治療年齡相關性白內障（ARC）提供實驗依據。
　　方法：
　?。?）SPF級雄性SD大鼠，經裂隙燈顯微鏡檢查排除雙眼晶狀體疾病及其他眼部疾病。適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為六組：空白對照組、模型對照組、杞菊地黃丸組、補青顆粒高、中、低劑量組，除空白對照組外，其余各組分別采用中波紫外線照

2、射復制SD大鼠晶狀體氧化應激模型，造模期間同時給予相應水溶液灌胃。陽性對照組選用杞菊地黃丸1g/ml水溶液灌胃；補青顆粒高、中、低劑量組分別給予4g/ml、2g/ml、1g/ml的水溶液灌胃；模型組、空白組均用生理鹽水（10ml/kg）代替藥物灌胃。實驗期間對大鼠精神狀況、視物情況、二便等一般情況進行每日觀察及記錄；對紫外線照射期間晶狀體的混濁程度進行動態(tài)觀察。造模成功指標：裂隙燈下觀察大鼠晶狀體周邊皮質，可見空泡。
　?。?）灌

3、胃結束后，選用HE染色法觀察晶狀體上皮細胞病理學組織情況；酶聯免疫吸附試驗法測血清中SOD、GSH-PX活性變化以及MDA含量改變。取空白組、模型組、陽性對照組、補青顆粒高劑量組各組晶狀體，采用實時定量聚合酶擴增反應（Real Time-PCR法）檢測晶狀體上皮細胞中VEGF、VEGF-R2以及SRC在RNA水平的表達；免疫組織化學法檢測晶狀體上皮細胞中VEGF、VEGF-R2、SRC以及P-SRC的表達情況；免疫蛋白印跡法（Weste

4、rn Blot法）測定晶狀體上皮細胞中VEGF、VEGF-R2、SRC以及P-SRC的蛋白表達水平。
　　結果：
　?。?）紫外線照射前期，各組大鼠無明顯盲目表現，行動自如，生長狀況良好，個別大鼠精神萎靡不振，偶見鼻衄等現象；后期各組大鼠均有精神不振、眼神迷離、嗜睡，明亮光線下，瞳孔縮小等白內障表現。裂隙燈下見空白對照組晶狀體無混濁，始終保持透明；紫外線照射第5天，晶狀體混濁不明顯；照射第10天，晶狀體纖維結構紊亂，水腫明顯

5、，大部分晶狀體皮質區(qū)見密集中等空泡，屬于Ⅱ期白內障；第15天晶狀體混濁程度加深，白內障不斷發(fā)展。
　　（2）造模期間，裂隙燈觀察結果示：在實驗進行開始階段，模型組在實驗進行到第三天時，Ⅰ期白內障發(fā)病率為57%，與空白對照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）；隨著紫外線照射時間的延長，模型組SD大鼠處于Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期例數以及百分比逐漸增高，與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。由結果可知，陽性對照組與補青顆粒各治療組均可

6、以延緩白內障發(fā)展，與模型組比較差異顯著（P＜0.05）；補青顆粒高劑量組效果最明顯（P＜0.05）。
　?。?）HE染色示：空白對照組晶狀體上皮細胞（lens epithelial cells,LECs）為單層立方上皮細胞，鏡下觀察，細胞形態(tài)整齊規(guī)則，纖維排列緊密；模型組LECs形態(tài)不規(guī)則，染色深淺不一，晶狀體纖維結構紊亂；陽性對照杞菊地黃丸組晶狀體組織損傷減輕，LECs排列較規(guī)則，染色淡，晶狀體纖維排列較完整；補青顆粒組晶狀體組

7、織損傷減輕，LECs排列致密工整，晶狀體纖維排列較杞菊地黃丸組完整，尤以補青高劑量組最明顯。
　　（4）免疫組化結果示：模型組SD大鼠晶狀體上皮細胞中VEGF、VEGF-R2、SRC以及P-SRC的陽性表達較空白對照組均明顯升高，差異具有顯著性（P<0.05）；藥物干預后，補青顆粒組、杞菊地黃丸組VEGF、VEGF-R2、SRC以及P-SRC陽性表達明顯降低，差異具有顯著性（P<0.05）；各治療組之間相比結果顯示，補青顆粒高劑量

8、組VEGF、VEGF-R2、SRC以及P-SRC陽性表達較杞菊地黃丸組減少，差異具有顯著性（P<0.05）。
　?。?）血清結果示：相比于空白對照組，模型組SOD、GSH-PX活性明顯降低，而MDA含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；藥物干預后，補青顆粒各治療組與杞菊地黃丸組比較結果顯示，隨著補青顆粒濃度的逐漸增高，SD大鼠血清中SOD、GSH-PX活性增加越顯著，MDA含量降低越明顯，且兩者的變化具有計量依賴性，差

9、異顯著（P＜0.05）。
　　（6）Real Time-PCR結果顯示：模型組與空白對照組相比，氧化應激狀態(tài)下，大鼠晶狀體組織中VEGF、VEGF-R2、SRC在RNA水平表達顯著升高，差異顯著性非常高（P＜0.01）；中藥干預后，補青顆粒組與模型組比較，VEGF、VEGF-R2、SRC在RNA水平表達有了顯著降低（P＜0.01）；而杞菊地黃丸組與模型組比較，VEGF mRNA、SRC mRNA表達差異不具有顯著性（P＞0.05）

10、；補青顆粒高劑量組與空白對照組比較，三種因子在RNA表達差異具有顯著性（P＜0.05）。
　　（7）Western Blot：紫外線照射之后，模型組與空白對照組相比，大鼠晶狀體中VEGF、VEGF-R2、SRC和R-SRC蛋白表達水平均有明顯升高，差異非常具有顯著性（P＜0.01）；而藥物干預后，各藥物治療組與模型對照組相比，VEGF、VEGF-R2和SRC蛋白表達水平，均有下降，差異具有顯著性（P＜0.01），而杞菊地黃丸治療組

11、R-SRC蛋白表達水平，與模型組比較，差異不具顯著性（P＞0.05）；補青顆粒高劑量組R-SRC蛋白表達水平，與空白對照組相比，差異顯著性不明顯（P＞0.05）；補青顆粒高劑量組與杞菊地黃丸組比較，具有明顯的差異性（P＜0.01）。
　　結論：
　　1、氧化應激可能是白內障發(fā)生的主要作用機制之一；
　　2、補青顆?？赡芡ㄟ^調節(jié)晶狀體中VEGF-VEGFR2-SRC等相關基因的表達，對紫外線照射所致大鼠晶狀體混濁的發(fā)生和