TrkB介導(dǎo)的失巢凋亡抑制與卵巢癌的轉(zhuǎn)移和耐藥.pdf

1、失巢凋亡(anoikis)是由于細胞與細胞外基質(zhì)和其它細胞失去接觸而誘導(dǎo)的一種程序化死亡形式，發(fā)生在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的起始階段，是抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的人體重要防御機制之一。PI3K/AKT信號通路參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在腫瘤細胞中PI3K/AKT信號通路通常異常激活。該信號通路激活后通過調(diào)控凋亡的線粒體途徑，介導(dǎo)凋亡/失巢凋亡抑制，使腫瘤細胞逃避凋亡從而賦予腫瘤細胞化療耐藥和高轉(zhuǎn)移。酪氨酸激酶受體B(tyrosinekinaserecept

2、or，TrkB)是原癌基因Trk-編碼神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸激酶受體(neurotrophictyrosinekinasereceptor，NTKR)的家族成員之一，其配體是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)。TrkB可通過激活PI3K/AKT信號通路抑制上皮細胞失巢凋亡和誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)移，在神經(jīng)母細胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和骨髓瘤等高侵襲腫瘤中過度表達。 研究表明：轉(zhuǎn)移

3、癌細胞的化療耐受性增強，故高轉(zhuǎn)移和化療耐藥有可能受控于相同的分子調(diào)控機制，失巢凋亡在這一過程中可能發(fā)揮重要的作用，抗失巢凋亡抑制可能是腫瘤治療的最新策略。高轉(zhuǎn)移和化療耐藥是卵巢癌的主要特征，但是迄今為止，TrkB在卵巢癌的失巢凋亡抑制及其與卵巢癌高轉(zhuǎn)移和化療耐藥的關(guān)系尚未見報道。在本研究中，以卵巢癌的失巢凋亡抑制為切入點，通過細胞貼壁培養(yǎng)模擬癌細胞在原發(fā)灶的生存狀態(tài)；通過立體培養(yǎng)篩選出獲得失巢凋亡抑制表型的癌細胞以模擬卵巢癌病人體內(nèi)脫離

4、原發(fā)灶發(fā)生轉(zhuǎn)移，并存活于腹水中的多細胞團簇的生存狀態(tài)；將多細胞團簇經(jīng)胰酶消化后再次貼壁培養(yǎng)，模擬體內(nèi)發(fā)生失巢凋亡抑制并生成轉(zhuǎn)移灶的癌細胞的生存狀態(tài)；研究TrkB是否介導(dǎo)卵巢癌細胞的失巢凋亡抑制及其信號調(diào)控機制。本文分以下三個步驟進行研究： 1.檢測TrkB在卵巢上皮性癌中的表達及其意義。研究結(jié)果提示：卵巢上皮性癌中存在TrkB及高親和力配體BDNF的過度表達；卵巢癌細胞獲得失巢凋亡抑制時，全長TrkB在其前體蛋白高表達的基礎(chǔ)上表

5、達明顯增加。 2.分析卵巢癌中TrkB過度表達與PI3K/AKT信號通路激活及其失巢凋亡抑制的關(guān)系。研究結(jié)果提示：卵巢癌中TrkB過度表達能激活PI3K/AKT信號通路并誘導(dǎo)卵巢癌細胞的失巢凋亡抑制。 3.探討TrkB誘導(dǎo)卵巢癌細胞失巢凋亡抑制的信號調(diào)控機制及其與卵巢癌高轉(zhuǎn)移和化療耐藥的關(guān)系。研究結(jié)果提示：TrkB過度表達激活PI3K/AKT信號通路，后者通過對Bcl-2家族蛋白表達及功能調(diào)控誘導(dǎo)卵巢癌的失巢凋亡抑制，使

6、其獲得高轉(zhuǎn)移和化療耐藥的特性。 本研究結(jié)論：在卵巢癌細胞中，酪氨酸激酶受體B在卵巢癌細胞中過度表達，并能激活PI3K/AKT信號通路，繼而該信號通路通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達及功能誘導(dǎo)卵巢癌細胞失巢凋亡抑制，最終賦予卵巢癌細胞高轉(zhuǎn)移和化療耐藥。 第一部分：酪氨酸激酶受體B在卵巢上皮性癌中的表達及其意義 目的：檢測失巢凋亡抑制因子酪氨酸激酶受體B(TrkB)在卵巢上皮性癌中的表達及其意義。 方法：RT

7、-PCR和real-timePCR、免疫組化、westernblot方法檢測卵巢上皮性癌組織(包括相應(yīng)的大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶和腹水中的癌細胞團簇)中TrkB及其配體-腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達；卵巢癌細胞系OVCAR-3細胞貼壁培養(yǎng)、立體培養(yǎng)以及細胞立體培養(yǎng)得到的多細胞團簇經(jīng)胰酶消化成單細胞后再次貼壁培養(yǎng)細胞TrkB的表達差異。 結(jié)果：RT-PCR結(jié)果顯示，TrkB及BDNFmRNA高表達于卵巢上皮性癌組織中，尤其高表達于大網(wǎng)

8、膜轉(zhuǎn)移灶和腹水中的癌細胞團簇中。大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶和腹水中的癌細胞團簇中的TrkB及BDNFmRNA相對表達量分別為31.43±1.41％和97.56±1.50％，28.20±0.72％和73.51±0.51％，與相應(yīng)的原發(fā)灶(18.06±1.09％和39.66±0.59％)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)；TrkB及BDNFmRNA在卵巢癌與卵巢交界性腫瘤中的相對表達量分別為11.71±2.12％和21.17±0.76％(卵巢癌)，4

9、.59±0.40％和12.60±0.88％(卵巢交界性腫瘤)，兩者在卵巢癌組織中表達明顯增加(P＜0.001)。與貼壁培養(yǎng)細胞比較，TrkBmRNA高表達于OVCAR-3多細胞團簇中，兩組數(shù)值分別23.51±0.51％，35.29±0.67％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)；BDNFmRNA的表達則正相反，兩組數(shù)值分別41.42±0.58％，32.23±0.70％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。并進一步行real-timePC

10、R檢測，結(jié)果與RT-RCR的相一致。免疫組化結(jié)果顯示，全長TrkB的前體蛋白(未發(fā)生糖基化的受體形式，表達于細胞漿)廣泛地高表達于卵巢上皮性癌組織中；全長TrkB(發(fā)生糖基化的完整受體形式，145000，表達于細胞膜)高表達于腹水中的癌細胞團簇和低分化卵巢癌組織中。Westernblot結(jié)果顯示，TrkB的前體蛋白(大約115000)，廣泛地高表達于上述三種不同培養(yǎng)方式的OVCAR-3細胞中；與貼壁培養(yǎng)細胞比較，OVCAR-3細胞立體培

11、養(yǎng)全長TrkB明顯高表達(P＜0.001)。 結(jié)論：卵巢上皮性癌中存在TrkB及B=DNF的過度表達，并且全長TrkB和BDNF在轉(zhuǎn)移癌、低分化癌中表達增加。這提示，卵巢上皮性癌腫可能存在TrkB/BDNFI的自分泌環(huán)路，TrkB可能是介導(dǎo)卵巢癌細胞失巢凋亡抑制的因子。 第二部分：酪氨酸激酶受體B過度表達與卵巢癌細胞PI3K/AKT信號通路激活及其失巢凋亡抑制的關(guān)系 目的：分析酪氨酸激酶受體B過度表達與卵巢癌細胞

12、PI3K/AKT信號通路激活及其失巢凋亡抑制的關(guān)系 方法：Westernblot、siRNA干擾技術(shù)檢測卵巢癌細胞系OVCAR-3細胞不同培養(yǎng)方式以及TrkB干擾前后PI3K/AKT信號通路活性的差異以及TrkB干擾后細胞失巢凋亡的情況。 結(jié)果：OVCAR-3多細胞團簇(細胞立體培養(yǎng))全長TrkB表達最多，PI3K/AKT信號通路活性最強，其次是OVCAR-3細胞立體培養(yǎng)得到的多細胞團簇經(jīng)消化成單細胞后再貼壁培養(yǎng)細胞，O

13、VCAR-3貼壁培養(yǎng)細胞全長TrkB的表達最少，PI3K/AKT信號通路活性也最弱(P＜0.001)，TrkB干擾后OVCAR-3細胞PI3K/AKT信號通路活性被抑制(P＜0.001)，OVCAR-3細胞失巢凋亡增加(P＜0.001)。 結(jié)論：TrkB過度表達能激活PI3K/AKT信號通路并誘導(dǎo)卵巢癌細胞的失巢凋亡抑制。 第三部分：酪氨酸激酶受體B誘導(dǎo)的卵巢癌細胞失巢凋亡抑制的信號調(diào)控機制及其與卵巢癌高轉(zhuǎn)移和化療耐藥的

14、關(guān)系 目的：探討酪氨酸激酶受體B介導(dǎo)的卵巢癌細胞失巢凋亡抑制的信號調(diào)控機制。 方法：Westernblot、siRNA干擾技術(shù)、MTT和FACS檢測OVCAR-3多細胞團簇、貼壁培養(yǎng)細胞以及貼壁培養(yǎng)細胞TrkB干擾聯(lián)合化療藥物作用后Bcl-Xl、Bad的表達差異；OVCAR-3多細胞團簇經(jīng)胰酶消化后再貼壁培養(yǎng)細胞與貼壁培養(yǎng)細胞經(jīng)單用化療藥物以及藥物聯(lián)合LY294002處理后對化療藥物敏感性差異；體內(nèi)、體外細胞侵襲實驗檢測

15、通過RNAi技術(shù)沉默TrkB后OVCAR-3細胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力的改變。 結(jié)果：OVCAR-3多細胞團簇Bcl-Xl、Bad的表達明顯高于貼壁培養(yǎng)細胞(P＜0.001)，TrkB干擾聯(lián)合化療藥物(紫杉醇、順鉑)作用后OVCAR-3貼壁培養(yǎng)細胞的Bcl-Xl、Bad的表達較單用化療藥物明顯減少(P＜0.001)。當紫杉醇作用后，OVCAR-3多細胞團簇Bcl-Xl、Bad的表達高于貼壁培養(yǎng)細胞；當順鉑作用后得出與上述相反的結(jié)果(P＜

16、0.001)。與普通貼壁細胞相比較，OVCAR-3多細胞團簇再次貼壁培養(yǎng)細胞顯示出增強的化療(紫杉醇、順鉑)耐受性(P＜0.001)，LY294002聯(lián)合紫杉醇在降低了OVCAR-3卵巢癌細胞的生存率(p＜0.01)的同時增加了細胞的凋亡(P＜0.001)。體體外細胞侵襲實驗表明OVCAR-3多細胞團簇的侵襲轉(zhuǎn)移能力較普通貼壁培養(yǎng)細胞明顯增強(P＜0.001)；TrkB沉默后OVCAR-3細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力受到抑制(P＜0.001)。