EZH2在鼻咽癌中的表達(dá)及其促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma)是我國(guó)南方及東南亞地區(qū)高發(fā)的一種惡性腫瘤，具有明顯的區(qū)域分布特征、種族聚集性以及強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)移傾向顯著區(qū)別于其他頭頸部腫瘤。目前所采用以放療為主的綜合治療提高了鼻咽癌的局控率，但五年生存率無明顯提高，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因。因此，繼續(xù)探索鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，積極尋找有價(jià)值的治療新途徑，減少轉(zhuǎn)移的發(fā)生具有重大意義。
　　 本課題組在研究miR-26a抑制鼻咽癌增殖的分子機(jī)

2、理時(shí)，發(fā)現(xiàn)其靶基因?yàn)楣墇este基因增強(qiáng)子人類同源物（enhancerofzestehomolog2，EZH2）。采用熒光定量PCR證實(shí)EZH2在高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞株5-8F中顯著高表達(dá)，且在發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌組織。基于這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果把EZH2定為促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移的候選癌基因。
　　 EZH2是PcG(polycombgroupgenes)家族中的一員，與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、腫瘤干細(xì)胞的自我更新及多種惡性腫

3、瘤的發(fā)病密切相關(guān)。值得注意的是，EZH2位于人染色體7q35，比較基因組雜交技術(shù)(CGH，Comparativegenomichybridization)證實(shí)此染色體區(qū)帶可能存在與鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。EZH2作為PCR2(polycombrepressivecomplex2)的催化亞基，其編碼的蛋白含有高度保守的SET結(jié)構(gòu)域，可通過三甲基化核小體組蛋白H3的27位賴氨酸(H3K27)或招募一系列效應(yīng)蛋白如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶等催化DNA甲

4、基化，來阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，最終實(shí)現(xiàn)基因沉默。多項(xiàng)研究表明，EZH2的表達(dá)失調(diào)與多種上皮源性和血液性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其高表達(dá)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，尤為重要的是EZH2還可以作為前列腺癌和乳腺癌病人預(yù)后判斷的一個(gè)分子指標(biāo)。
　　 EMT(Epithelialmesenchymaltransformation)是上皮細(xì)胞在形態(tài)上發(fā)生成纖維細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，獲得遷移和侵襲能力，擁有干細(xì)胞的特性，防止程序性

5、凋亡、衰老及抑制免疫原反應(yīng)。EMT有利于組織修復(fù)，加快臟器的纖維化及通過多種分子機(jī)制促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，特別在上皮源性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，EZH2可有序地沉默下游靶基因如上皮鈣粘素(E-cadherin)誘導(dǎo)EMT促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移。EZH2siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株MKN1后，免疫熒光表明β-catenin由核表達(dá)轉(zhuǎn)向膜表達(dá)，有相關(guān)研究顯示，β-catenin的核轉(zhuǎn)位與EMT的發(fā)生密切相關(guān)。由此提示我們E

6、ZH2有可能通過EMT參與鼻咽癌轉(zhuǎn)移。
　　 基于我們課題組的前期工作基礎(chǔ)和文獻(xiàn)依據(jù)，本課題擬通過免疫組化、熒光定量PCR和Westernblot分別驗(yàn)證EZH2在鼻咽癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)，同時(shí)分析其臨床意義;建立沉默或過表達(dá)EZH2的5-8F、6-10B鼻咽癌細(xì)胞模型，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，研究EZH2對(duì)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響;在EZH2表達(dá)失調(diào)后，通過熒光定量PCR、WesternBlot分析EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化，

7、本研究初步探討EZH2在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的功能和分子機(jī)制。
　　 材料和方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69采用KMSF培養(yǎng)基，人鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、6-10B、HONE1、CNE1、CNE2采取含10％胎牛血清和1％青鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，293FT細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基，在37°、5％CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2.臨床標(biāo)本

8、收集
　　 135例鼻咽癌組織和23例鼻咽慢性炎組織均來源于南方醫(yī)院耳鼻咽喉科和病理科的標(biāo)本庫(kù)，其中97例鼻咽痛組織具有5年隨訪資料，所有標(biāo)本均為鼻咽部活檢組織所制備的蠟塊，經(jīng)病理檢查確診，鼻咽癌組織學(xué)分型為非角化性未分化型鱗痛，所有患者均未接受放化療治療。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。
　　 3.免疫組織化學(xué)
　　 待檢組織的石蠟切片按SP免疫組化三步法進(jìn)行染色，經(jīng)切片脫蠟、抗原修復(fù)、

9、阻斷過氧化物酶、血清封閉、滴加一抗、滴加二抗、DAB顯色、復(fù)染、透明、封片等步驟后光鏡下觀察顯色結(jié)果。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，以陽性細(xì)胞數(shù)≥10％為陽性判定標(biāo)準(zhǔn);以陽性細(xì)胞百分比為陽性積分;以陽性積分的中位數(shù)(50％)作為臨界值，分為低表達(dá)、高表達(dá)組。
　　 4.慢病毒包裝、濃縮及滴度測(cè)定
　　 plVTHM/shEZH2和plVTHM/EZH2:該慢病毒表達(dá)載體可分別穩(wěn)定干擾和過表達(dá)EZH2，由香港中文大學(xué)醫(yī)學(xué)院陳楊超教

10、授惠贈(zèng)。采用lipofectamineTM2000法，將慢病毒表達(dá)載體（plVTHM或plVTHM/shEZH2或plVTHM/EZH2）和慢病毒包裝載體(psPAX2和Pmd2.G)共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，培養(yǎng)48～72h后收集病毒上清，超速離心進(jìn)行濃縮純化，病毒顆粒命名為L(zhǎng)V/shEZH2和LV/EZH2，空載組為L(zhǎng)V/control，再倍比稀釋進(jìn)行滴度測(cè)定。
　　 5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　 將慢病毒懸液感染鼻咽癌細(xì)胞，48

11、h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)發(fā)光情況。鑒于慢病毒感染效率較高，以GFP為標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選獲得GFP陽性細(xì)胞，分別建立穩(wěn)定干擾EZH2和過表達(dá)EZH2的鼻咽癌細(xì)胞株。
　　 6.熒光定量PCR
　　 抽提細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用SYBRgreen法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過相對(duì)定量以2-ΔΔCt值代表基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。
　　 7

12、.Westernblot
　　 抽提細(xì)胞的總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，然后10％SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交，超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-RadChemiDocXRS+ImagingSystem)成像，蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度采用ImageLab軟件進(jìn)行定量。
　　 8.細(xì)胞生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)
　　 (1)劃痕實(shí)驗(yàn):將5×105/孔細(xì)胞接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)12h，用200ul的加樣槍頭垂直在培養(yǎng)

13、孔中部制造多條互相平行的劃痕。培養(yǎng)液沖去脫落細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，應(yīng)用ImageJ軟件觀察并測(cè)量劃痕后0h、24h、48h細(xì)胞向致傷區(qū)遷移的距離。
　　 (2)InvasionChamber侵襲小室測(cè)定:胰酶消化細(xì)胞后以無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞制作細(xì)胞懸液，均勻加入200ul含1×105個(gè)細(xì)胞至小室上腔，加入600ul完全培基至transwell小室下腔，放置24h取出，4％多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。
　　

14、 9.肝包膜下種植肝肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立
　　 選擇4-6周齡的雄性裸鼠，體重18-24g，建立肝包膜下種植肝肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，24天后斷髓處死裸鼠后取出裸鼠肝臟及肺臟組織，4％多聚甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋并HE染色、顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞在肝肺內(nèi)轉(zhuǎn)移情況。
　　 10.EZH2表達(dá)失調(diào)對(duì)EMT相關(guān)指標(biāo)的影響
　　 在EZH2表達(dá)失調(diào)和對(duì)照組的鼻咽癌細(xì)胞中應(yīng)用熒光定量PCR、Westernblot、免疫熒光染色檢測(cè)EM

15、T上皮標(biāo)志物(E-cadherin、CK18)與間質(zhì)標(biāo)志物(β-catenin和N-cadherin)的mRNA和蛋白水平表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.鼻咽癌細(xì)胞中EZH2的表達(dá)
　　 熒光定量PCR結(jié)果顯示，在5種鼻咽癌細(xì)胞株，即5-8F、6-10B、HONE1、CNE1、CNE2的EZH2表達(dá)均高于永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69(F=707.589，P=0.000)。其中具有轉(zhuǎn)移能力的5-8F細(xì)胞中EZH2

16、的表達(dá)水平高于不轉(zhuǎn)移的細(xì)胞6-10B。Westernblot證實(shí)蛋白水平表達(dá)出現(xiàn)相同的變化。
　　 2.鼻咽癌組織中EZH2的表達(dá)
　　 (1)免疫組化結(jié)果表明:EZH2表達(dá)主要定位于細(xì)胞核。根據(jù)半定量積分計(jì)算，EZH2在135例鼻咽癌組織中陽性表達(dá)率為88.2％，該蛋白在23例鼻咽慢性炎組織中的陽性表達(dá)率為8.7％，兩者表達(dá)有顯著差異(P=0.000)。
　　 (2)根據(jù)EZH2的表達(dá)情況將鼻咽癌組織分成兩組，

17、高表達(dá)組和低表達(dá)組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，EZH2的表達(dá)與患者的性別、年齡均無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。EZH2的表達(dá)與患者的腫瘤T分期、N分期、M分期及臨床分期存在顯著正相關(guān)(P＜0.05)。
　　 (3)應(yīng)用Kaplan-Meier生存對(duì)具有5年隨訪資料的97例鼻咽癌組織進(jìn)行分析，結(jié)果顯示EZH2蛋白高表達(dá)組的鼻咽癌患者的生存時(shí)間較低表達(dá)組鼻咽癌患者明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 (4)Cox逐步回歸

18、模型檢驗(yàn)示:M分期和EZH2蛋白的表達(dá)這2個(gè)因素是影響鼻咽癌患者生存時(shí)間的重要因素（P＜0.05），腫瘤M分期對(duì)鼻咽癌患者的生存時(shí)間影響最大(P=0.000)。
　　 3.沉默或過表達(dá)EZH2對(duì)鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移影響的體內(nèi)外研究
　　 (1)建立穩(wěn)定沉默和過表達(dá)EZH2的細(xì)胞株
　　 依據(jù)慢病毒載體攜帶的GFP標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀分選獲得GFP陽性細(xì)胞群，建立穩(wěn)定沉默EZH2的鼻咽癌細(xì)胞株5-8F/shEZH2和穩(wěn)定

19、過表達(dá)EZH2的細(xì)胞株6-10B/EZH2。
　　 (2)沉默EZH2抑制鼻咽癌細(xì)胞遷移、侵襲能力
　　 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:沉默EZH2在24h、48h，均減慢鼻咽癌細(xì)胞遷移能力(P=0.000)，劃痕48h后其遷移能力下降了28.75％。
　　 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:沉默EZH2降低鼻咽癌細(xì)胞的侵襲力(P=0.000)，細(xì)胞侵襲力下降52.01％。
　　 (3)過表達(dá)EZH2促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移、侵襲能力

20、r>　　 過表達(dá)EZH2后，使本身不具有轉(zhuǎn)移能力的6-10B細(xì)胞，穿透力更增強(qiáng)5.49倍。
　　 (4)EZH2沉默對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響
　　 接種5-8F/control和5-8F/shEZH2鼻咽癌細(xì)胞的裸鼠，24天后肝臟成瘤率為100％。HE染色顯示，5-8F/control組肝內(nèi)見腫瘤細(xì)胞廣泛播散，肺轉(zhuǎn)移灶呈巢狀浸潤(rùn)，EZH2沉默組肝肺轉(zhuǎn)移灶少且較局限。5-8F/control組的肝肺轉(zhuǎn)移數(shù)目顯

21、著高于5-8F/shEZH2組(t=2.512，P=0.036;t=3.059，P=0.016)。
　　 4.EZH2表達(dá)失調(diào)對(duì)EMT相關(guān)指標(biāo)的影響
　　 (1)沉默EZH2可上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞的上皮標(biāo)志物，下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物
　　 熒光定量PCR均顯示，沉默EZH2后，5-8F/shEZH2細(xì)胞的上皮標(biāo)志物E-cadherin、Keratin18的mRNA水平分別上調(diào)1.83倍、1.61倍，間質(zhì)標(biāo)志物β-catenin

22、、N-cadherin分別下調(diào)42.7％、41.5％。WesternBlot分析其蛋白變化出現(xiàn)一致結(jié)果。
　　 (2)過表達(dá)EZH2后，上述EMT指標(biāo)的mRNA和蛋白水平表達(dá)出現(xiàn)相反的趨勢(shì)。
　　 結(jié)論:
　　 1.EZH2在鼻咽癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)上調(diào);免疫組化證實(shí)EZH2蛋白的表達(dá)與鼻咽癌的T分期、N分期、M分期和臨床分期顯著正相關(guān);EZH2的表達(dá)水平與患者的生存時(shí)間密切相關(guān)，EZH2的高表達(dá)可作為鼻咽癌預(yù)后