家蠶質多角體病毒RDRP的基因克隆、表達及定位研究.pdf

1、RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDRP)是RNA病毒增殖復制的重要酶類,具有轉錄酶和聚合酶的雙重活性,即一方面參與mRNA的轉錄,指導合成病毒增殖復制所需要的蛋白質和酶類;另一方面參與以病毒RNA為模版的子代病毒基因的復制.家蠶質多角體病毒(Bombyx mori Cytoplasmic Polyhedrosis Virus,BmCPV)是呼腸孤病毒科,質多角體病毒屬的代表種,為雙鏈

2、RNA病毒.已有的BmCPV冷凍電鏡三維重構的研究結果表明,在病毒衣殼五重軸的內表面各有一花形結構,位于B-突起(B-spike)的近內側,推測為轉錄酶復合物(TEC),可能是BmCPV結構蛋白VP2的對應成分.應用RT-PCR和分子克隆等技術成功地從BmCPV中國株的dsRNA中分三段克隆了RDRP基因,大小分別為1442bp,827bp,1675bp,進行基因全序列的拼接后,獲得了全長完整的BmCPV(C)RDRP基因(GenBan

3、k序列號為:AY496445),該基因全長3691bp,GC含量為41.99﹪,讀碼框為1-3678bp,共編碼1225個氨基酸(GenBank序列號為:AAR88092).應用Vector NT和DNAtools等軟件對其氨基酸序列一級結構進行預測和分析.對BmCPV-RDRP基因序列和pET-28b載體的限制性內切酶位點進行分析,設計合成三對表達引物,應用RT-PCR等技術利用pET-28b載體,成功構建了表達質粒pET28b-RD

4、RP,并用IPTG(1mmol/L)誘導的方法,在大腸桿菌BL21(DE3)中表達了帶有6×His的融合蛋白,蛋白質分子量為138kDa.應用分子生物學方法和免疫電鏡技術,通過對BmCPV(C)RDRP的基因克隆、表達及定位研究,使對BmCPV冷凍電鏡三維重構方面的研究成果與分子生物學方面的研究結果有機地結合,從而為尋找RDRP的活性中心,研究病毒在體內的復制機制、酶的功能和活性等方面提供理論基礎,也可以根據(jù)RDRP的活性中心結構開展短