磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及植物遺傳轉(zhuǎn)化正篩選系統(tǒng)的建立.pdf

1、根據(jù)GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中大腸桿菌(Escheriachiacoli)的磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(phosphomannoseisomerasePMI)序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR的方法得到約1200bp片段并與克隆載體pGM-Teasy連接，經(jīng)測(cè)序證明與已發(fā)表PMI序列同源性達(dá)到100％。將其作為選擇基因，構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBI-121上，得到可以在含有甘露糖的培養(yǎng)基上篩選的pBI-PMI、pBI-NPTII-PMI及pBI-k88-PMI

2、的表達(dá)載體。通過對(duì)普通煙草(NicotianatabacumL.)、番茄(LycopersiconesculentumMill.)、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)和甜瓜(CucumismelonL.)(伽師瓜)的甘露糖敏感性測(cè)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：普通煙草和紫花苜蓿不能用此轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行篩選。甜瓜(伽師瓜)和番茄LIGEER87-5可以用并得到較適合的篩選培養(yǎng)基：甘露糖濃度分別是19％和8％。以甜瓜(伽師瓜)(Cucumismelon

3、L.)，番茄(LycopersiconescμlentumMill.)LIGEER87-5為受體材料，通過根癌農(nóng)桿菌EHAl05(pBI-PMI、pBI-NPTII-PMI及pBI-k88-PMI)介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得了一批經(jīng)甘露糖篩選后的甜瓜和番茄芽，且這些分化芽能夠在含有甘露糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。通過氯酚紅(CPR)法對(duì)轉(zhuǎn)基因甜瓜葉片的磷酸甘露糖異構(gòu)酶做了定性分析，進(jìn)一步證明成功建立了以PMI為標(biāo)記基因的選擇系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可

4、以用于轉(zhuǎn)基因甜瓜和轉(zhuǎn)基因番茄的篩選。 實(shí)驗(yàn)一PMI基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建摘要：根據(jù)GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中大腸桿菌的磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(phosphomannoseisomerase，PMI)序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR的方法得到約1200bp片段并與克隆載體pGM-Teasy連接，經(jīng)測(cè)序證明與公布的PMI序列同源性達(dá)到100％。通過內(nèi)切酶消化、連接等方法進(jìn)一步構(gòu)建了含有不同標(biāo)記基因及目的基因的植物表達(dá)載體pBI-PMI、p