PSP驅(qū)動(dòng)CAPD基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建及在果樹中的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、我國是一個(gè)水果生產(chǎn)大國，栽培面積和產(chǎn)量均雄踞世界前列，但各種檢疫性、毀滅性的病害(如柑桔黃龍病、香蕉枯萎病和獼猴桃潰瘍病等)時(shí)刻威脅和制約著生產(chǎn)的發(fā)展。培育抗病品種是解決問題的根本途徑，但由于抗性資源缺乏且大部分果樹存在高度雜合、倍性復(fù)雜、育種周期長等問題，雜交育種等傳統(tǒng)的抗病育種手段難以奏效?，F(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展為果樹抗病育種提供了新的途徑，它可以獲得常規(guī)育種難以得到的新類型，從而創(chuàng)造出新種質(zhì)。迄今為止，絕大部分果樹抗病基因工程育種

2、采用的啟動(dòng)子是組成型的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子，采用的目的基因是來源于微生物或動(dòng)物、沒有經(jīng)過密碼子優(yōu)化的抗性基因，安全性、專一性和表達(dá)效率存在問題。本試驗(yàn)針對(duì)果樹上存在的一些韌皮部傳導(dǎo)的毀滅性病害(如柑桔黃龍病、香蕉枯萎病等)，首先從筍瓜中克隆了一個(gè)韌皮部特異性啟動(dòng)子，并根據(jù)密碼子用法分析結(jié)果，重新設(shè)計(jì)和合成了對(duì)這些毀滅性病害有殺滅作用的柞蠶抗菌肽D基因，然后構(gòu)建了多種由不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)標(biāo)記基因或目的基因的植物表達(dá)載體，最后利用新構(gòu)建的

3、植物表達(dá)載體在雙子葉木本果樹柑桔、藤本果樹獼猴桃和草本果樹草莓上進(jìn)行了轉(zhuǎn)化研究。主要研究結(jié)果如下： (1)、根據(jù)已報(bào)道具韌皮部組織特異性的筍瓜韌皮部蛋白PP2序列設(shè)計(jì)引物，以山西本地種筍瓜葉片基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增得到了長度為966bp的PP2基因啟動(dòng)子片段，把片段克隆入pUCm-T載體后，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR檢測和酶切鑒定后，獲得了新的重組質(zhì)粒pOCm—PSP，測序和序列分析表明與兩個(gè)已報(bào)道的片段分別有95％和9

4、9％的同源性，推測具有相似的啟動(dòng)子功能。 (2)、采用高頻密碼子分析法，分別對(duì)甜橙、溫州蜜柑、葡萄柚和檸檬等4種柑桔的蛋白質(zhì)編碼基因序列(CDS)進(jìn)行了分析，計(jì)算出了柑桔同義密碼子相對(duì)使用頻率(RFSC)，確定出了4種柑桔的高頻率密碼子，發(fā)現(xiàn)不同種類柑桔偏愛密碼子稍有差別，但不同種類柑桔的密碼子偏愛性是完全一致的。用同樣的方法，對(duì)柑桔現(xiàn)有的177個(gè)CDS進(jìn)行了分析，確定出了TAA、GCT、GAT、CTI、AGG、AGA和GTT等

5、7個(gè)高頻率密碼子。將柑桔的密碼子使用頻率與人、果蠅、酵母和大腸桿菌等不同種類模式生物比較后發(fā)現(xiàn)，柑桔密碼子的偏愛性與不同種類生物有不同程度的差異；但將柑桔的密碼子使用頻率與擬南芥、番茄、水稻和尖葉蕉等不同種類的植物相比，發(fā)現(xiàn)柑桔密碼子的偏愛性與同為雙子葉植物的擬南芥、番茄完全一樣，而與水稻、尖葉蕉這兩種單子葉植物均有較大的差異。分析結(jié)果對(duì)動(dòng)物或微生物的基因在柑桔中的表達(dá)或柑桔基因在微生物中的表達(dá)以及基因克隆時(shí)設(shè)計(jì)引物具有一定指導(dǎo)意義。

6、 (3)、根據(jù)177個(gè)GenBank中登錄的柑桔編碼蛋白密碼子用法的分析結(jié)果，優(yōu)化并重新設(shè)計(jì)和合成了含柑桔偏愛密碼子、對(duì)柑桔黃龍病等毀滅性病害有殺滅作用的柞蠶抗菌肽D基因(命名為CAPD)，克隆入pUC19克隆載體并經(jīng)測序驗(yàn)證后，獲得了含新抗病基因的重組質(zhì)粒pUC19-CAPD。 (4)、利用基因重組技術(shù)，分別構(gòu)建了pHZ01(來源于pBI121植物表達(dá)載體和pUC<,m>-PSP重組質(zhì)粒，由PSP驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因)、p

7、HZ02(來源于pCAMBIA1301植物表達(dá)載體和pUCm-PSP重組質(zhì)粒，由PSP驅(qū)動(dòng)GUSh報(bào)告基因)、pHZ03(來源于DCAMBIA1302植物表達(dá)載體和pUCm-PSP重組質(zhì)粒，由PSP驅(qū)動(dòng)GFP報(bào)告基因)和pHZ04(來源于pCAMBIA1303植物表達(dá)載體和pUCm-PSP重組質(zhì)粒，由PSP驅(qū)動(dòng)GFP和GUSh融合報(bào)告基因)等4個(gè)由PSP驅(qū)動(dòng)不同類型報(bào)告基因的新植物表達(dá)載體。利用細(xì)胞感受態(tài)法直接將4個(gè)原始的和4個(gè)新重組的

8、植物表達(dá)載體分別導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404、GV3101、EHA105和發(fā)根農(nóng)桿菌Ri15834等4個(gè)農(nóng)桿菌中，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來研究PSP的功能奠定了基礎(chǔ)。 (5)、同樣利用基因重組技術(shù)，分別構(gòu)建了pHZ05(來源于pBI121植物表達(dá)載體和含密碼子優(yōu)化的抗菌肽D基因的pUC19-CAPD克隆載體，由CaMV35S組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CAPD目的基因)和pHZ06(來源于pHZ05新植物表達(dá)載體和pUCm-PSP重組質(zhì)粒，由PS

9、P驅(qū)動(dòng)CAPD目的基因)2個(gè)分別由組成型和韌皮部特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CAPD抗病基因的新植物表達(dá)載體。利用細(xì)胞感受態(tài)法直接將2個(gè)新重組的植物表達(dá)載體分別導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404、GV3101、EHA105和發(fā)根農(nóng)桿菌Ri15834等4個(gè)農(nóng)桿菌菌株中，為利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)培育果樹抗病新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。 (6)、基于轉(zhuǎn)化體系建立所需要的高效再生體系，我們首先針對(duì)暗柳橙的不同外植體進(jìn)行了離體再生研究，以期得到較適合的外植體和

10、培養(yǎng)基配方。在不同梯度濃度6-BA與IBA、NAA組合的15種培養(yǎng)基上，對(duì)暗柳橙無菌實(shí)生黃化苗的上胚軸不同切段及子葉進(jìn)行再生分化培養(yǎng)，確定了暗柳橙在遺傳轉(zhuǎn)化中較為合適的培養(yǎng)基配方為MT+IBA0.5mg/L+6-BA 2.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L。上胚軸切段較其它部位外植體更適于用作遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。分別以含新構(gòu)建的植物表達(dá)載體pHZ05或pH06的EHA105農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行了暗柳橙無菌實(shí)生黃化苗的上胚軸的轉(zhuǎn)化研究，在

11、預(yù)培養(yǎng)、浸染、共培養(yǎng)之后，采用不同的篩選分化方式，確立了使用僅添加頭孢霉素抑制農(nóng)桿菌生長的培養(yǎng)基，至外植體開始進(jìn)行分化后再進(jìn)行抗生素梯度濃度篩選培養(yǎng)的方式。這種篩選方式既有利于轉(zhuǎn)化芽的生長，又可減少抗生素對(duì)轉(zhuǎn)化芽的抑制作用，還可以在高濃度抗生素條件下防止非轉(zhuǎn)化芽的逃逸。篩選培養(yǎng)4個(gè)月后，得到了一批轉(zhuǎn)基因抗性芽。取其中一部分大芽葉片，提取其基因組DNA，進(jìn)行多種引物的PCR檢測和目的基因PCR產(chǎn)物的測序比較，從10株轉(zhuǎn)pHZ05抗性芽中得

12、到3株轉(zhuǎn)基因植株，從60株轉(zhuǎn)pHZ06抗性芽中得到了11株轉(zhuǎn)基因植株。 (7)、以“布魯諾”實(shí)生無菌苗葉片為外植體，首先探討了葉盤放置方式和暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)不定芽再生的影響，建立了高效的組培再生體系；然后用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法，進(jìn)行了不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CAPD基因的轉(zhuǎn)化研究，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、浸染、共培養(yǎng)和篩選處理后，獲得了若干抗性芽；最后，取其中一部分大芽葉片，提取其基因組DNA，進(jìn)行多種引物的PCR檢測和目的基因PCR產(chǎn)物的測序比較，從6

13、0株轉(zhuǎn)pHZ05抗性芽中得到7株轉(zhuǎn)基因植株，從40株轉(zhuǎn)pHZ06抗性芽中得到了12株轉(zhuǎn)基因植株。 (8)、采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以草莓主栽品種“豐香”組培苗葉片為外植體，分別進(jìn)行了由組成型啟動(dòng)子和韌皮部特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)密碼子優(yōu)化抗菌肽D基因的轉(zhuǎn)化，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌浸染和共培養(yǎng)后，先進(jìn)行2周不加篩選抗生素的誘芽培養(yǎng)，然后經(jīng)Kan篩選，獲得了若干抗卡那霉素植株。提取部分抗性植株的基因組DNA，進(jìn)行多種引物的PCR檢測和目的基因PCR產(chǎn)