EST3-EGFP融合蛋白重組體的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、TNF-α是具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，在體內(nèi)以兩種形式存在：即17kD的分泌型TNF-α和26kD的跨膜型TNF-α。兩型TNF的殺瘤效應(yīng)不同，TM-TNF主要誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，盡管S-TNF也可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，但其誘導(dǎo)的壞死率常高于凋亡率。二型TNF均通過(guò)與TNFR結(jié)合發(fā)揮效應(yīng)，但誘導(dǎo)同一靶細(xì)胞死亡方式卻明顯不同，二者啟動(dòng)的胞內(nèi)信號(hào)分子及誘導(dǎo)基因表達(dá)均可能存在差異。 本室前期工作就二者誘導(dǎo)的差異基因之一EST3進(jìn)行全長(zhǎng)基

2、因延伸、克隆、表達(dá)和多克隆抗體的制備，初步檢測(cè)并證實(shí)了EST3定位于細(xì)胞核，表達(dá)于人PBMC，多種細(xì)胞系，肺，胎盤，小腸組織中。初步功能檢測(cè)證實(shí)與TNF的殺傷功能有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)基因工程技術(shù)將該基因與加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)連在一起，獲得EST3-EGFP融合蛋白，以便進(jìn)一步研究其表達(dá)和定位。主要結(jié)果如下： 一、pTriEx-EST3-EGFP構(gòu)建、克隆及鑒定 以pTriEx-EST3及pEGFP-N

3、1為模板，用PCR擴(kuò)增EST3和EGFPcDNA片段，重疊延伸PCR擴(kuò)增EST3-EGFP融合基因，BamHⅠ和EcoRⅤ雙酶切EST3-EGFP融合基因和pTriEx-4，并用T4DNA連接酶連接，獲得pTriEx-EST3-EGFP重組體。將其轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，獲得Amp抗性的陽(yáng)性菌落。以菌體PCR初步篩選陽(yáng)性克??；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅤ雙酶切鑒定，顯示有1.4kb及6.5kb兩片段，分別與EST3-EGFP連接片

4、段與空載體大小一致；進(jìn)一步DNA測(cè)序分析證實(shí)此重組體包含編碼去除終止密碼子后的EST3全部編碼序列及EGFP全長(zhǎng)編碼序列，沒(méi)有突變和移碼，提示EST3-EGFP融合蛋白的穿梭質(zhì)粒已構(gòu)建成功。 二、融合蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá) 以重組體轉(zhuǎn)化Rosetta(De3)pLacI感受態(tài)細(xì)菌，獲得Amp和Cam雙抗性的表達(dá)菌。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)EST3-EGFP融合蛋白，用10％SDS-PAGE分析，可觀察到分子量為57.8kD條帶從

5、誘導(dǎo)后2h開始出現(xiàn)，6h表達(dá)最強(qiáng)。由于表達(dá)載體在起始密碼之后有6個(gè)組氨酸和一些酶切位點(diǎn)，可編碼含有55個(gè)氨基酸的產(chǎn)物，其分子量約為6kD，加上25.5kD的EST3蛋白，26.3kD的EGFP蛋白，理論值為57.8kD。經(jīng)掃描分析，蛋白質(zhì)表達(dá)量占菌體蛋白總量的40％。用免疫印記證實(shí)57.8kD的分子可與抗EST3特異性抗體結(jié)合，而熒光顯微鏡證明細(xì)菌表達(dá)的融合蛋白中的EGFP可在菌體中發(fā)出綠色熒光，上述證據(jù)提示EST3-EGFP融合蛋白在