幾丁質(zhì)酶樣3蛋白1及基質(zhì)金屬蛋白酶-9在人頸動脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景：當(dāng)前的中國，經(jīng)濟(jì)和社會高速發(fā)展，人民物質(zhì)生活水平逐漸提高，飲食的多樣性逐漸增多，高脂肪、高膽固醇的食物攝取量增大，生活壓力的增大，運動量的減少，以及社會老齡化的進(jìn)展，導(dǎo)致動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生率逐年升高。動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是大多數(shù)血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ)及潛在危險因素，隨著中國社會逐漸步入老齡化進(jìn)展AS的發(fā)生、發(fā)展存在著巨大的危險，動脈粥樣硬化對人民健康有著巨大的威脅，給家庭和社會造成巨大的負(fù)擔(dān)。缺

2、血性腦卒中的發(fā)病率逐年升高,預(yù)后差、致死及致殘率高。目前其病因及發(fā)病機(jī)制還不完全清楚。頸動脈粥樣硬化的形成作為缺血性腦卒中最重要的危險因素,其與腦卒中的發(fā)生的部位、進(jìn)展及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。近年來國內(nèi)外大量研究表明，不穩(wěn)定斑塊的形成是急性心腦血管事件的主要原因。因此，不穩(wěn)定斑塊也成為國內(nèi)外研究的熱門方向，其主要的病理學(xué)特點包括纖維帽菲薄，脂質(zhì)核心較大和炎性細(xì)胞的大量浸潤。導(dǎo)致AS發(fā)生、發(fā)展的危險因素都可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，而后粘附分子

3、的表達(dá)顯著增加，趨化血液單核細(xì)胞及 T淋巴細(xì)胞粘附。單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)膜下啟動炎性反應(yīng)，導(dǎo)致大量細(xì)胞炎性因子的分泌，如腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF),白細(xì)胞介素(Interrukin,IL)，單核細(xì)胞趨化蛋白（Monocyte chemoattractant protein，MCP),等，可進(jìn)一步激活EC及血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）

4、、巨噬細(xì)胞，促進(jìn)AS進(jìn)一步發(fā)展。幾丁質(zhì)酶3樣蛋白1(Chitinase3-like1，CHI3L1)，又名YKL-40、軟骨糖蛋白39、乳腺回歸蛋白，該蛋白質(zhì)存在幾丁質(zhì)結(jié)合活性，但無幾丁質(zhì)酶活性。研究表明其可由一系列細(xì)胞分泌，并且參與了急性炎癥、慢性炎癥，以及細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrixc，ECM)重構(gòu)等疾病的過程，并起著至關(guān)重要的作用，如動脈粥樣硬化、糖尿病、支氣管哮喘、高血壓等，同時在斑塊不穩(wěn)定性中起著非常重

5、要的作用。基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase-9，MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中重要一員，MMP-9在動脈粥樣硬化病理過程中的所起的作用主要體現(xiàn)在促進(jìn)平滑肌細(xì)胞游離、遷移至內(nèi)膜下，形成粥樣硬化斑塊，從而促使粥樣硬化斑塊的進(jìn)展，其次對細(xì)胞外基質(zhì)以及膠原蛋白的降解，造成易損斑塊，使斑塊容易破裂。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝和降解，參與脂質(zhì)儲留、鈣質(zhì)沉著、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)行為改變等。它在降解 EC

6、M導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞遷移進(jìn)入血管內(nèi)中膜進(jìn)而引起內(nèi)-中膜（Intima thickness，IMT）增厚以及在斑塊形成的過程中、斑塊的不穩(wěn)定性起著重要的作用。然而在頸動脈粥樣斑塊組織中CHI3L1及MMP-9的表達(dá)水平是否存在變化，以及二者之間的是否有關(guān)聯(lián)性，目前未見相關(guān)報道。
　　研究目的：探討人頸動脈粥樣硬化斑塊組織中CHI3L1及MMP-9的表達(dá)水平，以及兩者之間的關(guān)系，希望進(jìn)一步探討頸動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，并尋找新的治療靶

7、點。
　　資料和方法：
　　1.收集自2012年4月至2014年4月在我科通過頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膜剝脫術(shù)獲得的完整的人頸動脈粥樣硬化斑塊標(biāo)本42例，其中男25例，女17例。所有病例術(shù)前常規(guī)行頸動脈彩超及頸動脈CTA及血管造影。另外，收集因外傷造成脾破裂于我科行脾臟切除術(shù)獲取的脾動脈20例，排除門靜脈高壓患者，其中男16例，女4例。作為對照組。所有患者術(shù)前均簽署《頸動脈粥樣硬化斑塊手術(shù)標(biāo)本研究知情同意書》，手術(shù)標(biāo)本離體后分成

8、兩部分，其中一部分迅速置于-80℃低溫冰箱保存，用于檢測CHI3L1、MMP-9的mRNA。另一部分置于10％的甲醛溶液中固定，待石蠟包埋切片，用于免疫組織化學(xué)的檢測。
　　2.對獲取標(biāo)本進(jìn)行HE染色，并根據(jù)術(shù)前彩超等將頸動脈粥樣硬化斑塊組織分為穩(wěn)定斑塊組（20例）、不穩(wěn)定斑塊組（22例），脾動脈組織作為對照組（20例)。
　　3.采用免疫組織化學(xué)SP法測定三組標(biāo)本中CHI3L1蛋白及MMP-9蛋白的表達(dá)水平，并分析CHI3

9、L1蛋白及MMP-9蛋白的意義以及二者之間的關(guān)系。
　　4.采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法分別檢測三組斑塊組織中CHI3L1mRNA及MMP-9mRNA的表達(dá)水平，并分析CHI3L1mRNA及MMP-9mRNA的意義以及二者之間的關(guān)系。
　　5.統(tǒng)計方法：實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，3組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，采用Pe

10、arson相關(guān)分析法分析人頸動脈粥樣硬化斑塊中CHI3L1、MMP-9蛋白及其mRNA表達(dá)的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義
　　結(jié)果：
　　1、免疫組織化學(xué)結(jié)果
　　1.1 CHI3L1主要在斑塊組織內(nèi)的著色表達(dá)主要位于炎性細(xì)胞、EC、VSMCS及泡沫細(xì)胞內(nèi)呈陽性表達(dá)。CHI3L1蛋白在斑塊組織中均有較強(qiáng)的表達(dá)，在對照組中表達(dá)較弱。三組中CHI3L1蛋白的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=482.407，P<0.0

11、01）。穩(wěn)定組斑塊中CHI3L1蛋白（2.087±0.027）表達(dá)高于對照組（1.946±0.019），不穩(wěn)定斑塊組織中CHI3L1（2.168±0.022）蛋白的表達(dá)也高于對照組，而且不穩(wěn)定斑塊組織中CHI3L1蛋白（2.168±0.022）的表達(dá)又高于穩(wěn)定斑塊組織中。
　　1.2 MMP-9在炎性細(xì)胞、EC及VSMCS、泡沫細(xì)胞內(nèi)呈陽性表達(dá)。MMP-9蛋白在斑塊組織中均有較強(qiáng)的表達(dá)，在對照組中表達(dá)較弱。三組中MMP-9蛋白的表

12、達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=488.210,P<0.001）穩(wěn)定組斑塊中MMP-9蛋白（2.098±0.025）表達(dá)高于對照組（1.967±0.026），不穩(wěn)定斑塊組織中MMP-9蛋白（2.233±0.031）的表達(dá)也高于對照組，而且不穩(wěn)定斑塊組織中MMP-9蛋白（2.233±0.031）的表達(dá)又高于穩(wěn)定斑塊組織中。
　　1.3 對斑塊組織中CHI3L1蛋白與MMP-9蛋白的表達(dá)情況采用Pearson相關(guān)分析顯示二者表達(dá)成正相關(guān)（

13、r穩(wěn)定蛋白=0.555，P<0.001；r不穩(wěn)定蛋白=0.618，P<0.001）。
　　2、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）結(jié)果
　　2.1 CHI3L1mRNA的表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=675.837，P<0.001），CHI3L1mRNA在不穩(wěn)定斑塊組織中的表達(dá)量最高（1.592±0.036），高于穩(wěn)定組斑塊中CHI3L1mRNA（1.338±0.046）表達(dá)的表達(dá)量，穩(wěn)定組斑塊中CHI3L1mRNA（1.33

14、8±0.046）的表達(dá)量高于對照組CHI3L1mRNA（1.157±0.033）的表達(dá)量。
　　2.2 MMP-9mRNA的表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=518.019，P<0.001)，MMP-9mRNA在不穩(wěn)定斑塊組織中的表達(dá)量最高（1.402±0.024），高于穩(wěn)定組斑塊中MMP-9mRNA(1.268±0.019)的表達(dá)量，穩(wěn)定組斑塊中CHI3L1mRNA（1.268±0.019）的表達(dá)量高于對照組MMP-9mRNA（1.1

15、83±0.023）的表達(dá)量。
　　2.3采用Pearson相關(guān)分析顯示斑塊組織中CHI3L1mRNA與MMP-9mRNA的表達(dá)量情況成正相關(guān)（r穩(wěn)定mRNA=0.536，P<0.001；r不穩(wěn)定mRNA=0.582，P<0.001）。
　　結(jié)論：
　　1. CHI3L1與MMP-9在人頸動脈粥樣硬化斑塊組織中高表達(dá)。
　　2. CHI3L1與MMP-9的高表達(dá)可能與人頸動脈粥樣硬化斑塊組織的不穩(wěn)定性有關(guān)。